JoVE Journal > Engineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ingeniería

Assemblaggio molecolare navette arricchite reversibilmente attaccato Kinesins

Published: January 26, 2019
doi:
10.3791/59068
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Columbia University

Summary

Presentiamo un protocollo per costruire navette molecolari, dove proteine motrici superficie-aderito chinesina propel microtubuli tintura-etichettati. Interazioni deboli di kinesins con superficie consente loro reversibile attaccamento ad essa. Questo crea un sistema su scala nanometrica che esibisce dinamico montaggio e smontaggio dei suoi componenti, pur mantenendo la sua funzionalità.

Abstract

Questo protocollo viene descritto come creare navette molecolari chinesina-alimentato con un attaccamento debole e reversibile del kinesins alla superficie. Contrariamente ai precedenti protocolli, in questo sistema, microtubuli reclutano proteine motrici chinesina dalla soluzione e metterli su una superficie. A sua volta, il kinesins faciliteranno lo scorrimento dei microtubuli lungo la superficie prima cedendo nuovamente dentro la soluzione di massa, essendo così disponibile ad essere reclutati nuovamente. Questo continuo montaggio e smontaggio conduce a colpire il comportamento dinamico del sistema, come la formazione di scie di kinesin temporaneo facendo scivolare i microtubuli di.

Diversi metodi sperimentali saranno descritti in tutto questo esperimento: spettrofotometria UV-Vis sarà utilizzato per determinare la concentrazione delle soluzioni di riserva di reagenti, coprioggetti in primo luogo essere ozono e raggi ultravioletti (UV) trattati e quindi silanizzata prima di essere montato in celle di flusso, riflessione interna totale di fluorescenza e microscopia (TIRF) utilizzerà per immagine contemporaneamente chinesina motori e filamenti di microtubuli.

Introduction

Le interazioni che regolano il comportamento di nanosistemi attivo sono sempre state caratterizzate da legami di lunga durata, quasi irreversibile1,2,3,4,5,6 ,7,8. Un esempio ben studiato di questo è il sistema di microtubule-chinesina, dove scivolante microtubuli sono azionati da irreversibilmente associato a superficie chinesina motori1,2,3,4, 5. Sistemi in cui i componenti sono reversibilmente collegati uno a altro sono stati studiato teoricamente9,10 e raggiunta la macroscala11,12, ma scala questi sistemi verso il basso per il su scala nanometrica è stato impegnativo. Uno dei motivi principali per questo è quella rottura e riformare i legami tra i componenti spesso richiede un grande cambiamento nelle condizioni ambientali. Anche se tali modifiche sono state implementate nel passato13,14,15, si affidano modificando il sistema stesso, piuttosto che adattarsi al suo ambiente. Progettazione di sistemi su scala molecolare in cui componenti continuamente assemblare e riorganizzare in strutture senza disturbare l’ambiente globale in cui gli esperimenti avvengono per aprire la porta all’esplorazione di una vasta gamma di comportamenti dinamici 16 , 17.

Qui, descriviamo e dimostrare il protocollo dettagliato per la creazione un dinamicamente montaggio e smontaggio sistema funzionamento su nanoscala. Il sistema e il relativo comportamento generale è stato introdotto precedenti18: filamenti di microtubuli sono azionati da tracce di reversibilmente associato a superficie chinesina-1 motori. Queste proteine motore di kinesin sono reclutate dalla soluzione per contribuire a spingere in avanti, i microtubuli prima cedendo nuovamente poco dopo. Una volta torna in soluzione, possono essere reclutate nuovamente per spingere un nuovo dei microtubuli. Nel passato13,14,15, la rottura e riforma delle obbligazioni necessarie modificazioni ambientali; al contrario, l’ambiente della nostra cella di flusso rimane invariato, mentre i motori di kinesin interagiscono con la superficie.

Questo protocollo aiuterà i ricercatori interessati (1) visualizzare tutti i passaggi del protocollo, e (2) assistere con risoluzione dei problemi di questo tipo di analisi. Esso è stato derivato dalle procedure descritte in Howard et al. 199319.

Protocol

1. preparazione soluzione Attenzione: Tre dei reagenti utilizzati in questo protocollo (toluene, dimetildiclorosilano e dithiothreitol) sono altamente tossici. Si prega di consultare le schede di sicurezza materiale (MSDS) prima dell’uso. Inoltre, parti del presente protocollo devono essere eseguite nell’ambito di un più elevato livello di protezione, indossare occhiali di sicurezza e due set di guanti protettivi, come indicato. Salvo diverso avviso, gli esperimenti possono essere condotti su banchi di laboratorio durante l’utilizzo di tutti gli appropriati dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice da laboratorio, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse). Nota: Le concentrazioni del ATP, chinesina e microtubuli che vengono utilizzati nel presente protocollo possono essere modificate dato le esigenze di ogni esperimento. Tuttavia, se modificato, assicurarsi che le concentrazioni finali di altri reagenti rimangono le stesse come indicato qui sotto. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a temperatura ambiente, (~ 25 ° C). Preparazione delle soluzioni madriNota: Preparare e aliquota le seguenti soluzioni in anticipo. Tutte le aliquote possono essere preparate a temperatura ambiente (~ 25 ° C). BRB80 tamponeNota: Il buffer per la maggior parte delle soluzioni utilizzate in questo protocollo è BRB80. BRB80 può essere preparato in grandi quantità e conservati in un congelatore a-20 ° C. Sciogliere 24,2 g di piperazina-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (tubi) e 3,1 g di idrossido di potassio (KOH) in 800 mL di acqua deionizzata per fare 800 mL di tubi 100 mM. Aggiungere 100 mL di 10 mM di cloruro di magnesio (MgCl2) e 100 mL di acido etilendiamminotetraacetico di 10mm glicole etilenico (EGTA) per ottenere un volume finale di 1 L. elevando il pH a 8 con idrossido di potassio (KOH) può aiutare nella dissoluzione dei tubi ed EGTA.Nota: Le concentrazioni finali dei prodotti chimici nel buffer BRB80 sono tubi da 80 mM, 1 mM MgCl2e 1 mM EGTA. Regolare il pH del buffer a 6,9 utilizzando KOH e acido cloridrico (HCl). ATP Preparare una soluzione di 1 mL di 100mm ATP in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-80 ° C. GTP Preparare una soluzione di 500 μL di 25mm GTP in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 5 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-80 ° C. MgCl2 Preparare una soluzione di 1 mL di 100 mM MgCl2 in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Caseina Pesare 1 g di secco caseina e trasferirlo in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Aggiungere 35 mL di buffer di BRB80 al tubo per sciogliere la polvere di caseina. Posto la soluzione in un bicchiere in una cella frigorifera per sciogliere tutta la notte. A questo punto, la soluzione avrà un aspetto denso e viscoso. Lasciare il tubo in posizione verticale in un frigorifero a 4 ° C per consentire qualsiasi grandi ciuffi non disciolti a stabilirsi. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Girare il tubo in una centrifuga a 1.000 x g a pellet fuori più precipitati. Ancora una volta, trasferire il surnatante in una nuova provetta. Ripetutamente e filtrare la soluzione utilizzando 0,2 μm (7 bar di pressione massima) filtri. La soluzione essere di spessore, molti filtri saranno intasarsi, quindi ripetere questo passaggio fino a quando il filtro è chiaro e unclogged. Determinare la concentrazione di caseina nella soluzione risultante mediante spettrofotometria UV/Vis, utilizzando il coefficiente di estinzione di caseina di 19 mM-1∙cm-1 a 280 nm20. Assumendo un peso molecolare di 23 kDa per caseina, diluire la soluzione ad una concentrazione di 20 mg∙mL-1 in BRB80. Dispensare la soluzione in 20 aliquote del μL e conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. D-glucosio Preparare una soluzione di 1 mL di 2 M D-glucosio in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Glucosio ossidasi Preparare una soluzione di 1 mL di 20 mg∙mL-1 glucosio ossidasi in BRB80. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Catalasi Preparare una soluzione di 1 mL di mg∙mL 0,8-1 catalasi in BRB80. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Ditiotreitolo (DTT)Nota: Poiché DTT è leggermente volatili e tossici, si prega di procedere come segue sotto cappa aspirante. Preparare una soluzione di 1 mL di 1 M DTT diluito in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Paclitaxel Preparare una soluzione di 1 mL di paclitaxel 1mm diluito in DMSO. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Solfossido dimetilico (DMSO)Nota: Il DMSO utilizzato in questi esperimenti è puro. Pipettare 1 mL di DMSO puro in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Fosfato della creatina Preparare un 1 mL di soluzione del fosfato della creatina 0,2 M in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Creatina fosfochinasi Preparare una soluzione di 1 mL di units· 200 L-1 del phosphokinase di creatina in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Solfato di nichel (II) Preparare 500 mL di una soluzione di solfato di nichel (II) di 50 mM in acqua ultrapura. Conservare la soluzione a temperatura ambiente (~ 25 ° C). Poly(Ethylene Glycol)-blocco-poly(propylene glycol)-blocco-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) soluzione Pesare 2 mg di PEG-PPG-PEG (peso molecolare medio numerico: 14.600 g∙mol-1)-polvere NTA su carta di pesatura. PEG-PPG-PEG-NTA è il copolimero Triblocco funzionalizzato con un gruppo (NTA) acido nitrilotriacetico. Fare riferimento alla Tabella materiali per maggiori dettagli su PEG-PPG-PEG-NTA. Trasferire la polvere in una microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 1 mL di soluzione di solfato di nichel (II) riserva al tubo. Vortex fino a quando la polvere si è sciolta e non visibili grumi rimangono. Archivio per fino a un mese a temperatura ambiente. Prima di iniziare un esperimento Riempire un secchio di ghiaccio. Prendere un’aliquota da ciascuno dei 13 reagenti descritti nelle sezioni 1.1.1 a 1.1.13 sopra e aggiungerli al secchio, così mantenendoli su ghiaccio. Disgelo di ciascuno dei reagenti prima dell’uso. Preparazione dei microtubuliNota: I microtubuli sono stati polimerizzati da un’aliquota di 20 μg di tingere-contrassegnati liofilizzato tubulina. La lunghezza d’onda di eccitazione della tintura è di 647 nm. Preparazione del buffer crescita dei microtubuli Dispensare 21,8 μL di tampone di BRB80 in una microcentrifuga piccolo (0,6 mL) del tubo. Aggiungere 1 μL di soluzione di riserva di MgCl2 , 1 μL di soluzione di riserva GTP e 1,2 μL della soluzione madre di DMSO.Nota: Così, le concentrazioni finali dei reagenti nel buffer BRB80 sono 4 mM MgCl2, 1mm GTP e solfossido dimetilico 5% (v/v). Polimerizzazione dei microtubuli Aggiungere 6,25 μL di tampone di crescita dei microtubuli direttamente in un’aliquota di 20 μg di tubulina liofilizzato con etichetta. Vortice l’aliquota per 5 s a 30 rps. Raffreddi l’aliquota sul ghiaccio per 5 min prima di esso in incubazione a 37 ° C per 45 min e procedere alla sezione 1.3.3. Stabilizzazione dei microtubuli Aggiungere 5 μL della soluzione di paclitaxel aliquotati 490 μL di tampone di BRB80. Vortice la soluzione per 10 s a 30 rps. Una volta i 45 min di incubazione per i microtubuli sono fino, aggiungere 5 μL della soluzione di microtubuli polimerizzato per la soluzione di BRB80/paclitaxel.Nota: Questa soluzione 100 volte microtubule diluito, stabilizzato, sarà essere appresso MT100. Può essere utilizzato fino a 5 giorni, e può essere diluito per ottenere la densità desiderata dei microtubuli per ogni esperimento. Soluzione di motilità Antifade enzimatica, sistema di rigenerazione di ATP e ATP Aggiungere 9.0 μL della soluzione di caseina aliquotati 291 μL di tampone di BRB80. Se la concentrazione di ATP desiderata per l’esperimento è inferiore a 1 mM, dispensare 83 μL della soluzione di BRB80/caseina in un nuovo tubo del microcentrifuge 0,6 mL. In caso contrario, dispensare 85 μL della soluzione in un nuovo tubo del microcentrifuge 0,6 mL. Aggiungere 1 μL di D-glucosio, 1 μL di glucosio ossidasi, 1 μL di catalasi e 1 μL di DTT a quel tubo.Nota: Queste sostanze chimiche costituiscono un enzimatica antifade cocktail21 che ridurrà photobleaching rimuovendo dissolto i radicali reattivi dell’ossigeno e tempra. Questo riduce la disintegrazione photobleaching e microtubuli causata dall’illuminazione di eccitazione durante la fluorescenza imaging22,23. Per gli esperimenti in cui la concentrazione di ATP è scelto per essere significativamente più basso di 1 mM, aggiungere i seguenti reagenti per la soluzione di creare un sistema ATP-rigenerante: 1 μL della soluzione del fosfato della creatina aliquotati e 1 μL della creatina aliquotata soluzione di creatinfosfochinasi. Aggiungere 1 μL di soluzione di ATP riserva alla soluzione di motilità. Flick o vortice l’aliquota per distribuire omogeneamente i prodotti chimici.Nota: Così, la concentrazione finale di sostanze chimiche nella soluzione sono 10 μM paclitaxel, 0,5 mg·mL− 1 caseina, 20 mM D-glucosio, 200 μg·mL− 1 glucosio ossidasi, catalasi− 1 μg·mL 8, 10 mM dithiothreitol, 2mm creatina fosfato (se aggiunto), 2 Units· L− 1 creatina fosfochinasi (se aggiunto) e 1 mM ATP. Questa soluzione sarà essere appresso la soluzione di motilità. KinesinNota: La soluzione di kinesin stock utilizzata in questi esperimenti è preparata da G. Bachand presso il centro per le nanotecnologie integrato presso i Sandia National Laboratories e reso disponibile ai sensi di un accordo di utente (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). il buffer utilizzato qui è costituito da imidazolo di 40 mM, 300 mM NaCl, 0.76 g · L-1 EGTA, 37,2 magnesio · L-1 EDTA, 50 g · L-1 saccarosio, 0,2 mM TCEP e 50 μM Mg-ATP. Per questa serie di esperimenti, è stato utilizzato il costrutto di kinesin rkin430eGFP. Si tratta di una chinesina costituito i primo 430 amminoacidi della catena pesante di ratto chinesina fusa a eGFP e un C-terminale His-tag al dominio coda24. Esso è stato espresso in Escherichia coli e purificata utilizzando una colonna Ni−NTA. La concentrazione della soluzione stock GFP-chinesina era 1,8 ± 0,3 μM, come determinato mediante spettrofotometria UV/Vis, utilizzando un coefficiente di estinzione per GFP di 55 mM-1ma-1 489 nm25, e tenendo conto che kinesin è un dimero. Determinare la densità di concentrazione o superficie di kinesin desiderata per l’esperimento. Per i dosaggi tipici, questa concentrazione è di 20 nM. Se la concentrazione di kinesin deve essere diluito più di un centuplo, diluirlo in una soluzione di BRB80 che contiene mg·mL 0,5-1 della caseina. Aggiungere 1 µ l di soluzione di kinesin alla soluzione di motilità al fine di ottenere una concentrazione finale di circa 20 nM. Microtubuli Aggiungere 10 μL di soluzione MT100 preparata nella sezione 1.3 per la soluzione di motilità.Nota: Questa soluzione di motilità può essere utilizzata fino a 3 ore. Dopo quel tempo, il sistema antifade perde la sua efficacia perché il glucosio nella soluzione è esaurito dalla reazione enzimatica. 2. assemblare le celle di flusso Lavare i vetrini coprioggetti Per celle di flusso, utilizzare un grande vetrino coprioggetti (dimensione: 60 x 25 mm) e una piccola (dimensioni: 22 x 22 mm)19. Risciacquare tutti i vetrini coprioggetti due volte con etanolo e due volte con acqua ultrapura. Sottoporre ad ultrasuoni i coprioggetti in acqua ultrapura per 5 min. farli asciugare in un forno ad una temperatura di 50 – 75 ° C. Utilizzando un UV/ozono pulitore (Vedi Tabella dei materiali e le istruzioni del produttore), trattare un lato di ogni vetrino coprioggetto per 15 min. eseguire questo passaggio può a temperatura ambiente (~ 25 ° C) e in condizioni atmosferiche normali (pressione di 1 atm). Girare con cautela ogni vetrino coprioggetti al suo lato (utilizzando una pinzetta) e UV/ozono trattare quel lato pure. Sonicare lamelle in acqua ultrapura ancora per 5 minuti prima di asciugarli nuovamente in forno ad una temperatura di 50 – 75 ° C. Il trattamento di lamelle per abilitare rivestimento PEG-PPG-PEGNota: Il dimetildiclorosilano e il toluene utilizzato in questa parte del protocollo sono altamente tossici, effettuare le seguenti operazioni sotto cappa aspirante, mentre prendendo le seguenti precauzioni: indossare due set di guanti protettivi e una camicia a maniche lunghe sotto il loro laboratorio cappotto. Tuck i bordi dei guanti all’interno le maniche della camicia in modo che nessuna pelle da avambracci è direttamente esposto ai prodotti chimici in caso di un versamento. Indossare occhiali protettivi. Diluire 25 mL di puro dimetildiclorosilano in 475 mL di toluene. Immergere ogni vetrino coprioggetti in soluzione di dimetildiclorosilano e toluene per 15 secondi. Lavare i vetrini coprioggetti due volte in toluene e tre volte in metanolo. Asciugare i vetrini coprioggetti usando azoto pressurizzato. Montaggio vetrini coprioggetti in celle di flusso Una volta asciutti i coprioggetti, tagliare un pezzo di 2 x 2,5 cm di nastro biadesivo verticalmente in strisce di due 1 x 2,5 cm. Mettere il vetrino coprioggetto grande su un tergicristallo delicato compito e attaccare le strisce di nastro longitudinale lungo i bordi del coprivetrino per creare un’area di 1 x 2,5 cm tra i pezzi di nastro. Attaccare il piccolo vetrino coprioggetto sopra le strisce di nastro per completare il montaggio di cella di flusso. 3. scorrere le soluzioni in una cella di flusso La cella di flusso assemblato, fluiscono approssimativamente 20 μL della soluzione di PEG-PPG-PEG. Il volume che è volato nella cella deve essere grande abbastanza per riempire la camera. Nei passaggi successivi, è necessario utilizzare lo stesso volume quando si scambiano le soluzioni. Consentire la soluzione di PEG-PPG-PEG assorbire sulla superficie per 5 minuti. La soluzione di PEG-PPG-PEG con buffer di BRB80 Exchange 3 volte dal fluire il buffer in. Fluire la soluzione di motilità in cella di flusso. Sigillare i bordi della cella di flusso con grasso per prevenire l’evaporazione se l’esperimento pianificato è più di un’ora.Nota: La cella di flusso è ora pronta per essere imaged. 4. imaging una cella di flusso Eseguire l’imaging utilizzando un’installazione di fluorescenza (TIRF) di riflessione interna totale del tipo di obiettivo per i microtubuli e i motori di kinesin (Vedi Tabella materiali).Nota: Qui, abbiamo usato un microscopio con una x 100 / 1,49 obiettivo di apertura numerica, utilizzando due laser, uno con una lunghezza d’onda di 642 nm e una potenza massima di 140 mW e l’altro con lunghezza d’onda di 488 nm e una potenza massima di 150 mW. Mettere una goccia di olio per immersione sull’obiettivo. Posizionare la cella di flusso sulla piattaforma microscopio e portare l’obiettivo fino a quando non c’è contatto tra l’olio sull’obiettivo e la cella di flusso. Utilizzare sistema di copertura di interblocco del microscopio per bloccare tutta la luce laser di fuggire. Accendere il laser e concentrarsi sulla superficie inferiore della cella di flusso. I microtubuli sono fluorescente etichettati ed eccitati alla lunghezza d’onda di 647 nm. Essi saranno essere imaged utilizzando un laser di nanometro 642 mentre un 488 nm laser è utilizzato per i motori di GFP-chinesina. Registrare le immagini o i video di interesse. In genere, la potenza del laser è di circa 30 mW e un tempo di esposizione di 50 ms per entrambi canali laser. Immagini possono essere registrate per finchè c’è motilità nella cella di flusso.Nota: L’illuminazione laser è nocivo per l’occhio nudo e può causare danni irreparabili. Si prega di assicurarsi che l’area illuminata è completamente coperto con un coperchio opaco.

Representative Results

In questi esperimenti, abbiamo usato un 1.000 volte diluizione dei microtubuli preparato nella sezione 1.3.2. La concentrazione di kinesin era 20 nM e la concentrazione di ATP era 1 mM. Imaging è stata eseguita usando la microscopia TIRF. Gliding microtubuli erano imaged separatamente dai motori kinesin: microtubuli erano visibili al momento di eccitazione con un laser di 647 nm (Figura 1, rosso), e la GFP-chinesina era visibile quando eccitato con un laser di 488 nm (Figura 1, verde). Il tempo fra eccitazione con la luce rossa e verde era meno di 1 s. Il tempo tra i fotogrammi era che 10 s. microtubuli visualizzato scivolante stabile. Il microtubule media velocità di scorrimento è stato approssimativamente 800 nm/s. La densità superficiale di microtubule era 400 mm-2. Tracce di kinesin (verde) è sembrato estendersi oltre l’estremità posteriore dei microtubuli (rossi) per parecchi micrometri. Figura 1: Gliding microtubuli azionati da motori debolmente associato a superficie chinesina. Come microtubuli sposta in avanti, si accumulano chinesina motori dalla soluzione. Questi motori si alternano tra due stati: singolo associato a microtubulo e doppio-legame microtubulo sia la superficie. Quando un doppio motore associato raggiunge la fine del microtubulo, il motore è lasciato alle spalle e lentamente dissorbisce dalla superficie con un tasso di fuori di circa 0.1 s-1. Di conseguenza, sentieri di kinesin motori rimangono dietro i microtubuli. Riga superiore: canale rosso (microtubuli). Riga centrale: canale verde (chinesina). Riga inferiore: combinato rosso (microtubuli) e verde (GFP-chinesina) canale. Barra della scala: 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

In questo lavoro, vi presentiamo un sistema attivo su scala nanometrica che auto assembla debolmente-associazione mattoni per costruire la propria traccia. Come illustrato nella Figura 1, scivolando microtubuli si accumulano chinesina motori dalla soluzione e li depositi sulla superficie. I motori di kinesin rimangono sulla scia del microtubulo per un breve periodo di tempo prima di tornare alla soluzione. Così, in questo esperimento, chinesina motori alternativi tra 3 stati:

(1) uno stato associato a singolo microtubulo: questo è quando una chinesina prima viene associato a un microtubulo. Esiste in equilibrio con stato (2).

(2) uno stato associato a doppio: in questo caso, una chinesina associato a singolo microtubulo si lega anche alla superficie tramite relativo His-tag. Questo stato di doppio-legame permette per la propulsione dei microtubuli.

(3) uno stato associato a superficie singolo: una chinesina di doppio-legame che ha camminato fuori dalla fine del microtubulo e non ha ancora sotto esame desorbita dalla superficie è in questo stato. Questi motori si possono osservare in Figura 1 (canali combinati e verde): essi si estendono dietro la coda del microtubulo per parecchi micrometri e formano la sua scia di diminuzione.

La fase più critica del presente protocollo è la formazione di superficie idrofoba sulla diapositiva. Non solo fa uso di sostanze chimiche pericolose, ma permette anche il PEG-PPG-PEG funzionalizzati con il gruppo NTA per rivestire la superficie, che permette quindi la chinesina di legare reversibilmente alla superficie. Un altro passo importante è tenuta la cella di flusso con grasso. Questo consente per l’imaging prolungata senza liquido nella cella di flusso, l’evaporazione.

Le modifiche principali per questa tecnica sono costituiti cambiando la concentrazione dei microtubuli, la concentrazione di kinesin e concentrazione di ATP. Cambiando la concentrazione dei microtubuli cambierà il numero dei microtubuli scivolando sulla superficie. Cambiando la concentrazione di kinesin cambierà il numero di molecole di kinesin che possono legarsi a microtubulo. Tuttavia, l’aumento della concentrazione di kinesin sopra gli importi già definito in questo esperimento potrebbe aumentare la fluorescenza di fondo, che lo rende più difficile vedere la scia di kinesin lasciata scivolare i microtubuli. Nel frattempo, abbassando le concentrazioni di ATP sotto 10 µM diminuirà significativamente velocità di scorrimento dei microtubuli. Se questo effetto è voluto, è necessario utilizzare un sistema composto fosfochinasi e fosfatasi di creatina di rigenerazione di ATP.

Una possibile limitazione di questa tecnica è che, a causa del contenuto di grande chinesina attivo del sistema, l’ATP può essere rapidamente consumato, ed esperimenti possono durare meno di un’ora in determinate condizioni. Per esempio questo sarebbe il caso se uno ha usato una duplice maggiore concentrazione di kinesin e cinque volte più alta concentrazione dei microtubuli che ciò che viene presentato in questo protocollo.

Nel nostro precedente lavoro18, abbiamo studiato la distribuzione spaziale di kinesin motori lungo i microtubuli, dimostrando che scivolando microtubuli accumulano chinesina motori da soluzione, con un conseguente aumento della densità di motori lungo la lunghezza della dei microtubuli. Abbiamo anche trovato che la stabilità di volo a vela dei microtubuli dimostrato una dipendenza non lineare alla velocità di concentrazione e dei microtubuli chinesina di soluzione.

Il protocollo presentato spiana la strada per un uso più efficiente dei motori della proteina in sistemi ingegnerizzato su nanoscala e per ulteriori indagini nella progettazione di nanosistemi attivi che sono in equilibrio dinamico. Inoltre, la natura dinamica di questo sistema permette di servire come sistema modello per lo studio di auto-guarigione e dinamica sostituzione di componenti molecolari, chiusura parte del divario tra strutture naturali e derivati dal.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario sotto grant NSF NSF-DMR 1807514. Gli autori ringraziano Bachand G. e V. Vandelinder per fornire la proteina GFP-chinesina. Quest’opera è stata eseguita, in parte, al Center for Integrated Nanotechnologies, un ufficio di scienza utente struttura gestita per l’US Department of Energy (DOE) Office of Science di Los Alamos National Laboratory (contratto n. DE-AC52-06NA25396) e Sandia National Laboratories (con-tratto n. 97 DE-AC04-94AL85000). Gli autori ringraziano il Dr. Jennifer Neff e AllVivo vascolare per il loro regalo di PEG-PPG-PEG funzionalizzati con NTA.

Materials

488 nm laser Omicron Laserage LuxX 488-150
642 nm laser Omicron Laserage LuxX 642
Casein Sigma C7078-500G
Catalase from bovine liver Sigma C40-500MG
Creatine Phosphate Sigma P-7936
Creatine Phosphokinase Sigma C3755-500UN
D-Glucose Sigma G2133-50KU
Dichlorodimethylsilane solution Sigma 40140-25ML Toxic
Dimethyl Sulfoxide Sigma 34869-100ML
Dithiothreitol Sigma D0632-5G Toxic
Eclipse TI Nikon Instruments
eGFP rkin430 Provided by George Bachand
EGTA Sigma E4378-25G
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A
Glucose Oxidase Sigma G0543-10KU
Guanosine Triphosphate Sigma G8877-10MG
Kimwipes Delicate Task Wipers Sigma Pharmaceuticals 8089
Magnesium Chloride Sigma M1028-100ML
Methanol Fisher Chemical A412 Toxic
Milli-Q Water Purification System Millipore Corporation
Nickel Sulfate Sigma 656895-50G
Paclitaxel Sigma T1912-5MG
PIPES Sigma P-6757
Pluronic F108-NTA Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular PEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic F-108 Sigma 542342-250G PEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 21-403-190
Toluene Fisher Chemical T324 Toxic
Tubulin, HiLyte647-labeled Cytoskeleton, Inc. TL670M
UV Ozone Procleaner BioForce Nanosciences PC440
Whatman Puradisc syringe filters Sigma WHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS Camera Andor Technology sCMOS 4.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule’s Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603 (2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919 (2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K., Ghosh, S. K. . Self-Healing Materials. , 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature’s Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -. C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L., Yada, R. Y. . Proteins in Food Processing (Second Edition). , 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

Tags

Molecular ShuttlesKinesinsMicrotubulesNanoscale Biological SystemsSelf-healingDynamic EquilibriumTubulinPaclitaxelCaseinATPKinesinMotility SolutionFlow CellCoverslips

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Bassir Kazeruni, N. M., Tsitkov, S., Hess, H. Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins. J. Vis. Exp. (143), e59068, doi:10.3791/59068 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image