Синтез и Bioconjugation тиоловых реактивной реагентов для создания сайта выборочно изменять Immunoconjugates

Радиофармацевтические химики давно эксплуатируемых избирательности и специфичность антител для биомаркеров болезни для обеих ядерных изображений и целевых радиотерапии¹. Далеко и прочь наиболее общий подход к radiolabeling антител основывается на неизбирательное придание radiolabeled протезно групп или radiometal энтеросорбенты аминокислоты — наиболее часто lysines — в рамках структуры иммуноглобулина ( Рисунок 1A)². Хотя эта стратегия является безусловно эффективным, его случайные, сайт неспецифический характер может создать проблемы. В частности традиционные bioconjugation подходы производят плохо определены и гетерогенных immunoconjugates состоит из смеси тысяч различных regioisomers, каждый со своим собственным набором биологических и фармакологические свойства³. Кроме того случайных bioconjugation могут препятствовать иммунореактивности антител, если груз добавляется иммуноглобулина антиген связывая доменов.

С годами разнообразные bioconjugation участкам и сайт селективные стратегии были разработаны с целью решения этих проблем^4,5. Наиболее распространенные из этих подходов основывается на лигирование maleimide подшипник зондов сульфгидрильных групп, по которым (рис. 1B). IgG1 антитела естественно содержат 4 Интер цепи дисульфидных мостов, связей, которые могут быть выборочно сведены к дают бесплатные тиолы способных претерпевает Майкл реакции с малеинимидов в форме succinimidyl тиоэфиры облигаций. Использование тиолами и малеинимидов, безусловно, улучшение по сравнению с традиционными методами и широкий спектр maleimide подшипник синтонов и бифункциональных хелаторов в настоящее время доступны. Однако важно отметить, что эта методология имеет также серьезные ограничения. На основе Maleimide immunoconjugates выставку ограниченное стабильности в естественных условиях, потому что тиоэфиры связь может пройти ретро Майкл реакции (рис. 2)^{6,,78,9, 10}. это, конечно, может привести к выпуска радиоактивных полезных данных или обмен с биомолекулами тиоловых подшипник в обращении (например, глутатион или альбумина в сыворотке крови). Оба из этих процессов можно увеличения концентрации деятельности в здоровых органов, а также уменьшение концентрации деятельности в тканях-мишенях, обусловило уменьшение контрастность изображений и ниже терапевтические показатели. Были разработаны несколько альтернативных тиоловых реактивной реагентов в попытке обойти эти проблемы, включая tosylates, bromo – и Иодо acetyls и винил сульфонов^{11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17}. Однако все эти подходы имеют ограничения, которые препятствуют их широкое применение.

Около пяти лет назад, в лаборатории в конце Карлос Barbas III научно-исследовательском институте Скриппса пионером в использовании phenyloxadiazolyl метил сульфонов как реагенты для селективного формирования высокостабильных связей с тиолами (Рисунок 1 c и рис. 3) ^{18 , 19}. авторы заняты phenyloxadiazolyl метил сульфон подшипник вариант флуоресцеин изменить несколько антител, спроектирован, чтобы содержать остатки свободной цистеина, в конечном счете производства immunoconjugates с более высокой стабильности, чем аналогичные конструкции, созданные с помощью датчиков на основе maleimide. Увидев этой перспективной работы, мы были несколько удивлены тем, что эта технология использовалась только вряд в радиохимии и еще не было вообще используется в синтезе бифункциональных хелаторов или radioimmunoconjugates^20,21 . Эта нехватка приложений, однако, вскоре начал делать больше смысла: несколько попыток закупки реагент от Sigma-Aldrich привело к получения сложных смесей продуктов разложения с < 15% нужного соединения. Кроме того, обобщение сообщенных реагент себя был не является реалистичным вариантом либо, как опубликованные синтетических маршрут несколько громоздкой и требует сложных органической химии оборудование, большинство радиохимии и Молекулярное воображение лаборатории — включая ours — просто не обладают.

В ответ на эти препятствия мы намереваемся создать легко доступны и очень стабильной phenyloxadiazolyl метил сульфона реагент, который может быть получен через надежную и разумно снисходительный синтетических маршрут. Ранее в этом году, мы сообщили создание модульный, стабильный и легко доступны phenyloxadiazolyl метил сульфона реагент — называли «СТРУЧКИ» — как платформы на основе тиоловых bioconjugations (Рисунок 1 c и рис. 3)²². Ключевое различие между СТРУЧКИ и реагент сообщил Barbas, et al. является, что бывший использует анилин кольцо, прикрепленное к phenyloxadiazolyl метил сульфона остаток, в то время как последняя имеет фенола в таком же положении (рис. 4). Это изменение облегчает более простой и доступной синтетических маршрутов, а также — если наш опыт с коммерчески доступные соединения является символом — более стабильной окончательный реагент. В этой работе, мы также синтезируется пару СТРУЧКИ подшипник бифункциональных хелаторов — СТРУЧКИ-ДФО и СТРУЧКИ-CHX-A”-DTPA — содействовать созданию ⁸⁹Zr – и ¹⁷⁷Лу меченых radioimmunoconjugates, соответственно. Как мы будем обсуждать, мы продемонстрировали, что на основе СТРУЧКИ сайт селективного bioconjugations можно воспроизвести и энергично создать однородную, четко определенных, весьма иммунореактивных и высокостабильных radioimmunoconjugates. Кроме того доклинические эксперименты в мышиных моделях колоректального рака показали, что эти сайт выборочно помечены radioimmunoconjugates выставку Улучшенный в естественных условиях производительности по сравнению с radiolabeled антитела синтезируются через на основе maleimide спряжения.

Сквозные цель этой работы заключается в содействии созданию четко, однородной, очень стабильный и высоко иммунореактивных immunoconjugates для приложений в vitro и in vivo. Синтетический подход является достаточно простым, чтобы выполняться в почти любой лаборатории, и родитель СТРУЧКИ реагента могут быть изменены с множеством различных энтеросорбенты, флуорофоров или грузов. В этот протокол и сопровождающих видео мы будем описывать простые, четырехступенчатая синтез СТРУЧКИ (рис. 5); Создание СТРУЧКИ подшипник вариант DOTA, широко используемый хелатором для координации ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ¹¹¹, ¹⁷⁷Лу и ²²⁵переменного тока (рис. 6); и bioconjugation СТРУЧКИ-DOTA в модели антитела, трастузумаб HER2-таргетинг IgG1 (рис. 7).