Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.
Genes de virulência bacteriana frequentemente são regulados a nível transcricional por múltiplos fatores que respondem a sinais ambientais diferentes. Alguns fatores agem diretamente sobre os genes de virulência; outros controlam patogênese ajustando a expressão dos reguladores a jusante ou a acumulação de sinais que afetam a atividade do regulador. Enquanto o regulamento tem sido estudado extensivamente durante o crescimento em vitro , relativamente pouco se sabe sobre como a expressão gênica é ajustada durante a infecção. Tal informação é importante quando um produto do gene específico é um candidato para a intervenção terapêutica. Abordagens transcriptional como RT-PCR em tempo real, quantitativo e RNA-Seq são maneiras poderosas para examinar a expressão do gene em um nível global, mas sofrem muitos desafios técnicos, incluindo baixa abundância de RNA bacteriano comparado ao RNA do hospedeiro e amostra degradação por RNases. Avaliar o Regulamento usando repórteres fluorescentes é relativamente fácil e pode ser multiplexado com proteínas fluorescentes com propriedades espectrais únicas. O método permite a célula única, spatiotemporal análise de expressão gênica em tecidos que apresentam tridimensional arquitetura e physiochemical gradientes complexos que afetam redes de regulação bacterianas. Tais informações são perdidas quando dados são calculados sobre a população em massa. Aqui, descrevemos um método para quantificar a expressão gênica em patógenos bacterianos in situ. O método baseia-se no processamento do tecido simples e observação directa da fluorescência das proteínas de repórter. Vamos demonstrar a utilidade deste sistema, examinando a expressão de Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), cujo produto gênico é necessário para evasão imune e virulência completa ex vivo e in vivo. Mostramos que nuc-gfp é fortemente expressos em abcessos renais e revelar expressão de gene heterogêneo devido em parte à aparente regulação espacial da atividade de promotor nuc em abcessos totalmente engajado com a resposta imune. O método pode ser aplicado a qualquer bactéria com um sistema genético manipulável e qualquer modelo de infecção, fornecendo informações valiosas para o desenvolvimento de drogas e estudos pré-clínicos.
Bactérias respondem às novas condições fisiológicas e alterações no estado nutricional de seu ambiente expressando diferencialmente genes necessários para adaptação e sobrevivência. Por exemplo, patógenos oportunistas colonizam o corpo superfícies em relativamente baixa densidades e muitas vezes são inofensivos. No entanto, uma vez que a bactéria penetrou barreiras físicas e químicas, deve lidar com as Counter-defesas de célula imune do hospedeiro e disponibilidade de nutrientes restrita1. Por exemplo, Staphylococcus aureus coloniza aproximadamente um terço da população assintomaticamente, mas é também a causa do devastador de pele e infecções de tecidos moles, osteomielite, endocardite e bacteriemia2. O sucesso de S. aureus como um patógeno é frequentemente atribuído à sua flexibilidade metabólica, bem como um arsenal de fatores de virulência associada a superfície e secretada que permitem que a bactéria escapar na corrente sanguínea e replicar em tecidos periféricos 3,4,5. Porque o anfitrião a morte devido à doença estafilocócica é um beco sem saída evolutivo e transmissão de limites a novos hospedeiros6, o compromisso com a produção de factor de virulência deve ser cuidadosamente controlado.
Uma complexa rede de regulação das proteínas e responde RNA não-codificante para uma variedade de estímulos ambientais, incluindo celular, densidade, fase de crescimento, fatores associados neutrófilos e disponibilidade de nutrientes, para garantir que os genes de virulência são expressos nas hora exacta e localização dentro do hospedeiro, tecidos7,8,9,10,11,12,13. Por exemplo, o sistema de dois componentes de SaeR/S (TCS) regula a expressão de vários fatores de virulência através da quinase do sensor (PEA) e a resposta regulador (SaeR)14. Pea é autophosphorylated em um resíduo de histidina conservada em resposta a sinais (por exemplo,, humana neutrófilos peptídeos [HNPs], calprotectin) de acolhimento a8,15,16. O grupo de fosforilo é então transferido para um resíduos de aspartato na SaeR, ativando-o como uma proteína de ligação a DNA (SaeR ~ P)17. O TCS SaeR/S regula mais de 20 genes que contribuem para a patogênese incluindo fibronectina proteínas (FnBPs) e leucocidinas estafilococos coagulase14,18,19,20. Metas podem ser classificadas em alvos de alta afinidade e baixa afinidade do gene, que possam induzido como o nível de SaeR ~ P levanta-se quando exposto a suas sugestões21. A atividade de SaeR/S é controlada por outros reguladores da expressão gênica, como o sistema de sensoriamento de quórum Agr, repressor de proteína de toxinas (Rot) e a alternativa fator sigma B (SigB)22,23,24.
NUC é um gene de virulência Sae-dependente em Staphylococcus aureus e codifica thermonuclease (Nuc), que é essencial para escapar do neutrophilic extracellular traps (redes) e para divulgação durante o curso de infecção25,26. A expressão do nuc é também fortemente indiretamente reprimida pelo CodY na presença de aminoácidos de cadeia ramificada e GTP27e diretamente reprimida pela proteína estafilocócica regulador acessório SarA28,29 , cuja actividade é influenciada pelo oxigênio (estado de redox) e pH30. Dado que sae e nuc mutantes são atenuados em modelos do rato de infecção, há interesse em desenvolver intervenções químicas que inibem a sua correspondente atividades26,31. Apesar disso, não há nenhuma informação sobre sua regulação durante a infecção.
Repórteres fluorescentes tem sido usados para monitorar e quantificar a expressão do gene no nível da célula única. Neste documento, apresentamos um método para a quantificação dos S. aureus expressão gênica durante a infecção que, quando combinadas com in vitro transcriptome análise e poderosas técnicas de imagem como a ressonância magnética (MRI) e espectroscopia de ressonância magnética (MRS), pode revelar como bacteriana fisiologia está regulamentada no vivo e a abundância relativa de nutrientes em determinados nichos. O método pode ser aplicado a qualquer agente patogénico bacteriano com um sistema genético tractable.
Visão geral do vetor Integrativa do genoma.
O genoma Integrativa vector pRB4 contém 500 pares de bases cada das regiões a montante e a jusante do pseudogene do S. aureus USA300 SAUSA300_0087 para facilitar o recombination homologous. pRB4 é derivado de backbone sensíveis à temperatura pMAD vetor contendo a gaveta de resistência de eritromicina (ermC) e beta-galactosidase thermostable gene bgaB para rastreio de azul/branco, recombinants32. A construção de engenharia repórter também contém um marcador de resistência de cloranfenicol (gato) para a seleção após a integração do genoma e eliminação do plasmídeo, bem como locais de EcoRI e SmaI para fundir a região reguladora de interesse para verde superfolder proteína fluorescente (sGFP) (Figura 1). É conhecido que a escolha do sítio de ligação do ribossomo (RBS) influencia a atividade do repórter e muitas vezes requer otimização empírica33. Assim, um RBS não é fornecido. Aqui, o sítio de ligação do ribossomo nativo é usado para fornecer um padrão mais natural da expressão do gene, mas outros sites podem ser utilizados.
Doenças infecciosas bacterianas são um crescente problema de saúde em todo o mundo devido à aquisição de resistência aos antibióticos determinantes46. Porque a adaptação a ambientes de host é essencial para o crescimento e sobrevivência durante a infecção, estratégias visando programas de expressão do gene que aumentam a aptidão do patógeno podem ser útil terapeuticamente. Um desses programas é o conjunto de genes controlados pelo sistema de dois componentes de SaeR/S (TCS), mo…
The authors have nothing to disclose.
Alexander Horswill Agradecemos o presente da fusão de tdTomato – PsarAP1e Karen Creswell para ajuda com análise de citometria de fluxo. Agradecemos também a Alyssa King para aconselhamento sobre análise estatística. Este trabalho foi financiado em parte por uma NIH exploratório/Developmental Research Award (grant AI123708) e fundos de inicialização da faculdade para SRB. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e interpretação ou a decisão de submeter o trabalho para publicação.
5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
glass beads | Sigma | Z273627 | |
Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
PCR purification | QIagen | 28106 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
Plate reader | Tecan | NA | |
Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |