En fluorescens-baserad metod för att studera bakteriell genreglering i infekterade vävnader

Bakterier reagera på förändrade fysiologiska förhållanden och förändringar i den näringsmässiga delstaten sin omgivning genom att differentially uttrycka gener som krävs för anpassning och överlevnad. Exempelvis kolonisera opportunistiska patogener kropp ytor vid relativt låga tätheter, och är ofta ofarliga. Men när bakterien har trängt in fysiska och kemiska hinder, måste det brottas med värd immunceller Counter försvar och begränsade näringsämnen tillgänglighet¹. Som ett exempel, Staphylococcus aureus colonizes ungefär en tredjedel av befolkningen asymptomatiskt men är också orsaken till förödande hud och mjukdelsinfektioner, osteomyelit, endokardit och bakteriemi². Framgången för S. aureus som en patogen är ofta tillskrivas dess metaboliska flexibilitet samt en arsenal av surface-associerade och utsöndrade virulensfaktorer som gör att bakterien att fly i blodomloppet och replikera i perifera vävnader ^3,4,5. Eftersom värd dödsfall på grund av staphylococcal sjukdom är en evolutionär återvändsgränd och gränser överföring till nya värdar⁶, måste åtagandet att virulens factor produktion kontrolleras noga.

Ett komplext regulatoriska nätverk av proteiner och icke-kodande RNAs svarar på en mängd stimuli från omgivningen, inklusive cell densiteten, tillväxtfas, neutrofila-associerade faktorer och näringsämnen tillgänglighet, att säkerställa att virulensgener uttrycks på den exakt tid och plats inom värd vävnader^{7,8,9,10,11,12,13}. Exempelvis reglerar SaeR/S tvåkomponentssystem (TCS) uttryck för flera virulensfaktorer via den sensorn kinase (SAE: er) och svar regulator (SaeR)¹⁴. Kapacitetsminskningen är autophosphorylated på ett bevarat histidin rester i svar till värd signaler (t.ex., humana neutrofila peptider [HNPs], calprotectin)^8,15,16. Phosphorylen gruppen överförs sedan till en aspartat rester på SaeR, aktivera den som en DNA-bindande protein (SaeR ~ P)¹⁷. SaeR/S TCS reglerar över 20 gener som bidrar till patogenes inklusive Fibronektin bindande proteiner (FnBPs), leukocidins och koagulas^14,18,19,20. Mål kan klassificeras till hög affinitet och låg affinitet gen mål, vilket sannolikt induceras som nivån på SaeR ~ P stiger när de utsätts för sina ledtrådar²¹. SaeR/S verksamhet styrs av andra regulatorer av genuttryck som Agr quorum sensing systemet, repressor gifter proteinkälla (röta), och den alternativa sigma faktor B (SigB)^22,23,24.

NUC är en Sae-beroende virulens gen i Staphylococcus aureus och kodar thermonuclease (Nuc), som är nödvändig för att fly från neutrophilic extracellular trappar (nät) och för spridning under de Kursen infektion^25,26. Uttrycket av nuc är också starkt indirekt förträngas av CodY i närvaro av grenade aminosyror och GTP²⁷, och direkt förträngas av proteinet staphylococcal tillbehöret regulator SarA^28,29 , vars verksamhet påverkas av syre (redox staten) och pH³⁰. Med tanke på att sae och nuc mutanter är försvagade i musmodeller av infektion, finns det intresse att utveckla kemiska interventioner som hämmar deras motsvarande aktiviteter^26,31. Trots detta finns det ingen information angående deras reglering under infektion.

Fluorescerande reportrar har använts för att övervaka och kvantifiera genuttryck på enstaka cellnivå. Häri, presenterar vi en metod för att kvantifiera S. aureus genuttryck under infektion som, när det paras ihop med in vitro-transkriptom analys och kraftfulla avbildningstekniker som magnetisk resonanstomografi (MRT) och magnetisk resonans spektroskopi (MRS), kan avslöja hur bakteriell fysiologi är reglerade i vivo och de relativa förekomsten av näringsämnen i vissa nischer. Metoden kan tillämpas på alla bakteriella patogener med ett fogligt genetiska system.

Översikt av genomet integrativ vektorn.

Den genomet integrativ vektor pRB4 innehåller 500 baspar varje från uppströms och nedströms regioner av det S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene att underlätta homolog rekombination. pRB4 härstammar från temperaturkänsliga pMAD vector ryggraden som innehåller erytromycin resistance kassett (ermC) och termostabila beta-galaktosidas gen bgaB blå/vit screening av rekombinanter³². Den bakåtkompilerade reporter konstruktionen innehåller kloramfenikol motstånd markör (katt) för urval efter genomet integration och plasmid eliminering, liksom mina och Bruno platser till säkring regionen föreskrivande av intresse för superfolder grön fluorescerande protein (sGFP) (figur 1). Det är känt att valet av Ribosomen bindningsstället (RBS) påverkar aktiviteten av reportern, och kräver ofta empiriska optimering³³. Således tillhandahålls en RBS inte. Här webbplatsen infödda ribosom bindning används för att ge för ett mer naturligt mönster av genuttryck, men andra platser får användas.