Aquí, presentamos un protocolo guía de manejo de organoide de próstata primario humano y sugerir criterios de valoración para evaluar el fenotipo. Siembra, mantenimiento de la cultura, recuperación de gel de la matriz, cuantificación morfológica, incrustar y seccionamiento, FFPE seccionamiento, todo Monte tinción y aplicación de ensayos comerciales se describen.
Este papel describe un protocolo detallado para tridimensional (3D) de cultivo, manejo y evaluación de organoides de próstata primario humano. El proceso implica la siembra de células epiteliales escasamente en un gel de matriz 3D en una microplaca de 96 pocillos con los cambios de los medios de comunicación para cultivar expansión en organoides. Morfología se evalúa entonces todo bien capturando imágenes z-stack. Compresión de pilas de z crea una imagen en foco que organoides se miden para cuantificar una gran variedad de productos, incluyendo la circularidad, la redondez y la zona. DNA, RNA y proteínas se pueden recoger en organoides recuperado del gel de la matriz. Poblaciones celulares de interés pueden evaluarse por la disociación de organoides y citometría de flujo. Formol-fijación–inclusión en parafina (FFPE) seguido de seccionamiento se utiliza para la evaluación histológica y anticuerpos. Conjunto montaje coloración inmunofluorescente conserva morfología organoide y facilita la observación de la localización de la proteína en organoides en situ. Ensayos comerciales que tradicionalmente se utilizan para las células de la monocapa 2D pueden modificarse para 3D organitas. Utilizan juntos, las técnicas en este protocolo proporcionan una robusta caja de herramientas para cuantificar la expresión de marcadores de diferenciación, crecimiento organoide próstata y características morfológicas.
Organoides son una valiosa herramienta para el estudio de la organogénesis y la enfermedad. Ofrecen una alternativa menos costosa a modelos animales y organoides derivados del paciente están evolucionando como estrategia de medicina personalizada1,2,3. Este sistema de cultivo (3D) tridimensional implica la siembra de células madre o progenitoras (extraídas del tejido o inducida de células madre pluripotentes) en un gel de matriz extracelular componentes (gel de la matriz)4. Las células proliferan y diferencian, dando lugar a estructuras organotypic que recapitulan la jerarquía celular y morfología de los órganos de la unidad funcional de interés. Organoides se han cultivado con células procedentes de una variedad de órganos, incluyendo glándulas salivales, estómago, intestino, hígado, próstata, pulmón y cerebro4. Aunque existen numerosos protocolos que describen los pasos para establecer organitas próstata5,6, es difícil encontrar métodos suficientemente detallados sobre cómo lograr criterios de valoración cuantitativas de organoides. Este artículo resume los métodos desarrollados para las células humanas de próstata primarias y detalla una serie de puntos finales sugeridos para determinar los fenotipos de organoide. Estas técnicas fueron optimizadas para próstata organoides y pueden ser aplicables a otros cultivos celulares 3D.
Organoide próstata culturas han surgido recientemente como un modelo valioso en vitro que carece de las limitaciones de las culturas de monocapa utilizando estableció líneas celulares inmortalizadas. Epitelio benigno de próstata y cáncer de próstata es un desafío al modelo en vitro con líneas celulares inmortalizadas. El número de líneas celulares benignos es limitado, y todos han experimentado transformación con oncogenes7. Células epiteliales próstata primarias en monocapas no se diferencian en las células luminales y carecen de receptores de andrógeno8. La mayoría de líneas celulares de cáncer de próstata no tienen receptores androgénicos funcionales, un importante mediador de estado temprano de la enfermedad y falta clave los cambios genéticos que se han encontrado en tumores de pacientes9. Organoide próstata culturas pueden cultivarse fácilmente de epitelio benigno y son valiosas en el estudio de propiedades de células madre, células progenitoras, la diferenciación y efectos de los cambios experimentales en el microambiente4,5. Cáncer de próstata organitas pueden cultivarse como parte de un enfoque de la medicina de precisión para modelado de enfermedad del paciente y la respuesta a terapias10.
Este protocolo ha sido recopilada de los protocolos que utilizan diversos tipos celulares, pero se ha optimizado aquí para su uso en células humanas de próstata primarias. Complementa los protocolos descritos por aserradores, Clevers y Shen5,6 que describen el crecimiento, pases, proyección de imagen de campo claro, criopreservación y aislamiento de ARN y ADN de próstata mouse y organitas humano. Se modifica el protocolo conjunto de montaje de Mahé et al. 11, organitas epitelial gastrointestinal que describe en vivo imagen y congelados e inclusión en parafina. Borten et al. 12 se describe el análisis de mama, colon y cáncer colorrectal organoide morfología de proyección de imagen de campo claro. Además, Richards et al. 13 utiliza un método para la evaluación morfológica de próstata organitas. Finalmente, Hu et al. 14 describe un método de adhesión próstata organitas en una diapositiva de la cámara durante la noche antes de la tinción inmunofluorescente para observar las células y la dispersión de las esferas para el análisis de citometría de flujo.
El objetivo de este protocolo es demostrar detalladamente estos métodos técnicamente desafiantes como un protocolo, incluyendo la siembra de la célula; los medios de comunicación y de la matriz del gel mantenimiento; colección de células por citometría de flujo; ARN, ADN y extracción de proteínas; evaluación morfológica de análisis de campo brillante z-stack; inclusión, de transformación y seccionamiento para tinción histológica; y todo por inmunofluorescencia o análisis de la sonda fluorescente. La importancia biológica y la interpretación de estos diferentes criterios de valoración variarán entre anticuerpos utilizados para análisis y diseño experimental. A través de la utilización de este protocolo, los usuarios deben sentirse preparados para establecer un experimento con un conjunto de puntos finales.
Células epiteliales prostáticas primarias humanas (PrE) se establecieron en el laboratorio por el protocolo descrito por Peehl15,16 y mantiene a un número limitado de pasajes (hasta cuatro) como se describió anteriormente17, pero también son disponibles de proveedores comerciales. Hepatocitos libre de suero basado en los medios de comunicación6, KSFM-base13y R-spondin acondicionado 15 medios de comunicación se publican como haber elaborado con éxito organitas. KSFM-basado requiere la menor cantidad de aditivos, por lo que se describe aquí.
Cultura Organotypic es un emocionante nuevo método para recapitular el tejido con la comodidad de un ambiente en vitro . Actualmente, laboratorios crecen organoides de muchos tipos de tejidos para diferentes extremos. Los métodos descritos en este artículo Resumen extremos útiles y destacan nuevas técnicas para caracterizar totalmente los cultivos celulares de próstata primario 3D.
Hay una gran variedad de recetas de medios de cultivo de células humanas de próstata primario organitas5,6,13. Mientras todos obtener resultados viables y comparables, KSFM-medios de comunicación13 utiliza aditivos mínima por lo que se describe aquí. Además, se han publicado documentos utilizando varias concentraciones para el gel de la matriz, desde 10% hasta un 75% a cultura organitas próstata5,6,13. Porque el gel de matriz es un reactivo caro, y gel de matriz 33% ha demostrado ser suficiente para cultivar a largo plazo (2-3 semanas), viable, las organitas13, esto es la concentración recomendada. Sin embargo, gel de la matriz puede variar en la concentración de proteínas entre los números de lote, para que esto debe tenerse en cuenta cuando de la galjanoplastia. Se recomienda también comprar gel de la matriz a granel para uso a través de múltiples experimentos para reducir la incongruencia entre lotes. Otros laboratorios han publicado diferentes formatos de gel de la matriz, como gotas en lugar de una placa de 96 pocillos bien5la capa de la galjanoplastia. Ambos métodos forman organitas viable, pero el formato aquí descrito permite células a ser plateado más escaso, que se ha demostrado para promover la expansión de las células en mayor organitas13. Sin embargo, galjanoplastia densidad debe ser optimizada basada en eficiencia de formación específico para cada paciente. Gel de matriz está disponible en varios formatos incluyendo el factor de crecimiento reducido, sin rojo de fenol, alta concentración, etcetera. Reducido factor de crecimiento se recomienda definir las condiciones de cultivo y sin rojo fenol se recomienda cuando se trabaja con las células que expresan GFP o en experimentos que involucran la captura de imágenes z-pila. Es fundamental que cualquier pasos de galjanoplastia de gel de matriz sea realizado con reactivos helados, como gel de la matriz se solidifica rápidamente a temperatura ambiente.
Organoides bajo diferentes tratamientos experimentales pueden resultar en cambios a la forma, así la proyección de imagen de campo claro es ampliamente utilizada para el estudio de fenotipos morfológicos observados. Sin embargo, registro y cuantificación de área o forma es un reto por dos razones: 1) selección sesgada durante la captura de la imagen y 2) aplicando un parámetro bidimensional como tridimensional muestra. Una estrategia de captura de la imagen es registrar un campo al azar y medir un número predeterminado de organoides en ese campo, pero esto puede crear sesgo durante la selección y organitas todos en el campo seleccionado pueden no estar en foco. Proyección de imagen de todo bien optimizado para el formato de microplacas de 96 pocillos elimina este sesgo de muestreo recolectando el organoide toda población de interés. Sin embargo, dependiendo de los objetivos de microscopio en mano, múltiples campos deba recogerse y azulejos con el fin de obtener una imagen de todo bien. Algunos laboratorios han descrito área medición de un solo plano z12, pero para capturar todos los organoides en foco, se recomienda recoger y apilar varios planos en una sola imagen FED13. En algunos casos, un menisco en el gel de la matriz puede provocar viñeteo en la imagen, y métodos de corrección de fondo deba aplicarse mediante software de análisis de imagen. Volumen exacto ideal es la medición más adecuada para tamaño de organoides; sin embargo, esto es difícil de obtener precisión, incluso con múltiples imágenes z-stack. Otras dimensiones morfológicas útiles, tales como la circularidad y la relación de máximos y mínimos, pueden calcularse fácilmente de todos los organoides en una imagen de la Fed de todo bien. Juntos, estos métodos superar retos sesgos de muestreo y permitan la medición de parámetros 2D de objetos 3D en un espacio 3D.
Fijación de formalina y de inclusión en parafina de organoides es un método común para obtener la hematoxilina y eosina (H & E), inmunohistoquímica (IHC) y coloración inmunofluorescente (IF) para visualización y análisis6,11, 20. sin embargo, publicaciones que han descrito esta técnica carecen de información completa sobre el proceso de inclusión. Además, puede ser difícil localizar organitas dentro del bloque de parafina. Algunos laboratorios la manchan organoides con trypan azul antes de incrustar para ayudar en la ubicación en la sección11. El método descrito aquí incorpora el uso de un colorante histológico para la orientación de la gelplug de organoide/histología durante la incrustación para promover la eficiencia de seccionamiento. Diapositivas de H & E facilitan examen de necrosis, textura nuclear y proliferación, y así debe ser un punto final obligatorio de organoide cultura para asegurarse de que las células estén sanas a lo largo de la esfera. Una fuerza de la cultura de organoide es que las muestras se componen de una mezcla heterogénea de células que parecen mejor en vivo paciente tejido. En la próstata, por ejemplo, las células basals y luminales están presentes en la próstata organitas5, mientras que las células cultivadas en 2D falta diferenciación luminal8. Para evaluar la diferenciación organoide, es aconsejable que los investigadores evaluación marcadores basales como CK5 y p63 y luminal como receptores de andrógenos y CK88. Cualquier otras proteínas experimentales de interés también pueden ser estudiadas usando estas técnicas de tinción.
Aunque las secciones FFPE permiten la visualización de las células que residen en el compartimiento interno vía histologic métodos (H & E, si, IHC), imágenes se limitan a los cortes transversales, y forma de organoides puede ser alterado por el proceso de inclusión. Conjunto montaje coloración permite un organoide teñidas y observadas en situ, conservación de fenotipos morfológicos y permitiendo imágenes de localización de la proteína. Montaje de conjunto es una herramienta utilizada para teñir a muestras todo tejido o animal entero, como el embrión de pez cebra o el ratón y se adapta fácilmente para el organitas. La técnica descrita aquí fue modificada al procedimiento por Mahéet al. 11, que detalla el crecimiento inicial y la cultura de organoides gastrointestinal directamente en un portaobjetos de la cámara para la tinción y requiere la fijación de la cultura de todo padre. El método descrito aquí consiste en la transferencia de un organoide único (u organoides) de interés en un portaobjetos de la cámara en el momento de la coloración. Esto permite la selección de organoides individuales para el análisis conjunto de montaje en un experimento continuo sin la fijación de la cultura de los padres. Al realizar montaje en conjunto la coloración, es necesario optimizar la permeabilización y el tiempo de incubación para los anticuerpos primarios y secundarios asegurar penetración a lo largo de la muestra (en cualquier parte de uno o más días es recomendado). Una vez fotografiado mediante microscopía confocal, se pueden producir renders 3D para activar la visualización y localización de una proteína específica y calcular el número de células teñidas positivamente presentes en una muestra. Citometría de flujo es un extremo útil para cuantificar poblaciones de basal, luminal, o células madre5,14. Para hacer esto, las células son recuperadas del gel de la matriz y ligeramente disociadas para tinción. Los usuarios deben seleccionar cuidadosamente marcadores apropiados para la separación basada en la literatura actual. Para humanas primarias próstata las células epiteliales, CD26 y CD49f son convenientes marcadores luminales y basals, respectivamente de5,21.
En Resumen, este protocolo detalla crecimiento organoide de próstata primario humano, recolección y variables principales de evaluación experimental. De la nota, la técnica de montaje descrita puede aplicarse a una variedad de otros ensayos que se emplean normalmente para células 2D, como los experimentos basados en la punta de prueba fluorescentes mirando manchas de organelo subcelular, apoptosis y proliferación19. Además, el método de colección y disociación descrito aquí podría utilizarse en la preparación de unicelular de la secuencia de RNA18. Colectivamente, esto demuestra la posibilidad de una variedad de la novela, los extremos de alta fidelidad que los investigadores pueden optimizar y explorar en el futuro.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los miembros de la UIC Biorespository, Dr. Klara Valyi-Nagy y Alex Susma, así como los urólogos, los Drs. Michael Abern, Daniel Moreira y Simone Crivallero, para la facilitación de la adquisición de tejido para las culturas de célula primaria. Agradecemos a los pacientes de Urología de la UIC para donar sus tejidos para investigación. Este trabajo fue financiado, en parte, por el Departamento de defensa de la próstata cáncer de investigación programa salud disparidades Idea Premio PC121923 (Nonn) y UIC centro clínico y traducción recibió educación para (clínicos y científicos traslacionales PECTS) programa (McCray y Richards) y por los institutos nacionales de Salud Instituto Nacional del cáncer, Grant números U54CA202995, U54CA202997 y U54CA203000, conocida como la Chicago salud equidad colaborativo (Nonn y Richards). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud o el Departamento de defensa.
Cells of interest | |||
Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
Ice Bucket | |||
Cell Culture Hood | |||
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
Centrifuge | |||
Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
Organoids | |||
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
Organoids | |||
Ice pack | |||
Masking tape | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Razor blade | |||
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
Pencil | |||
"Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
Container to hold fixative | |||
10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
Deionized water | |||
Paraffin | Leica | various | |
Tissue processor | |||
Embedding workstation | |||
Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
Microtome | |||
Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
Deionized water (DI H2O) | |||
Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
1x Phosphate Buffered Saline – PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
Confocal microscope | |||
Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
Staining dish | IHC World | M900-12B | |
Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
Organoids | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Pipette tips (200 μL) | |||
8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
Confocal microscope | |||
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
Organoids | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Pipette tips (200 μL) | |||
8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
1x Phosphate Buffered Saline – PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
Organoids | |||
Ice bucket | |||
Cell culture hood | |||
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
Microcentrifuge | |||
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
Cytokeratin 5 Antibody – FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
Cytokeratin 8 Antibody – Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
CD49f – Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
CD26 – PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |