Manutention et évaluation de la Culture humaine Organoïde la Prostate primaire

Le protocole suivant a été optimisé en utilisant humains cellules épithéliales de la prostate primaires, récoltées dans les tissus du patient à l’Université de l’Illinois à l’hôpital de Chicago. Tous les tissus humains utilisés pour ces expériences ont été acquises via l’Institutional Review Board-a approuvé le protocole et/ou dispense à l’Université de l’Illinois à Chicago. Alors que les conditions de culture varient selon le type de cellule d’intérêt, les points de terminaison peuvent servir à organoïdes des autres tissus. 1. ensemencement des cellules épithéliales dans la matrice Gel et évolution des médias Recueillir les matériaux nécessaires : primaire la prostate cellules épithéliales humaines (GER), gel de matrice sur la glace, microplaque 96 puits, kératinocytes milieux sans sérum (KSFM) sur la glace, du charbon de bois dépouillé sérum fœtal (SVF) et la dihydrotestostérone (DHT). Préparer les milieux organoïde axée sur les KSFM en combinant 47,5 mL de KSFM avec 2,5 mL de charbon FBS dénudées et de la dihydrotestostérone (DHT) à une concentration finale de 10 nM DHT, puis réserve sur la glace. Cellules de la plaque dans une matrice 3D sous une hotte de culture cellulaire en utilisant une technique stérile. Doucement mélange froid organoïde axée sur la KSFM des médias avec gel glacé matrice pour obtenir une matrice de 50 % de mélange de gel lentement pipetage de haut en bas, en évitant les bulles.Remarque : Gel de la matrice devrait être décongelé toute la nuit à 4 ° C et gardé sur glace lorsque cela est possible. Elle se solidifie rapidement à température ambiante (RT). Pré mouillage un embout de la pipette dans les médias froids et transférer 40 – 50 μL de matrice de 50 % de gel sur la partie inférieure de chaque puits pour être utilisé sur une plaque à 96 puits. Recouvrir le fond du puits pour former une couche de base.Remarque : Dispensent pas pleinement à la deuxième étape sur la pipette graduée, car cela peut créer des bulles. Placer la plaque à 96 puits dans l’incubateur de 37 ° C pendant 30 à 45 min solidifier la couche de base.Remarque : Plaque pas de cellules épithéliales sur la couche de base jusqu’à ce qu’il se solidifie, ou cellules peuvent tomber à travers la matrice sur la partie inférieure de la plaque et se développer comme une monocouche. Mélanger des cellules épithéliales suspendus dans les médias organoïde axée sur les KSFM avec le gel de la matrice pour obtenir une concentration finale de 100 – 1 000 cellules/100 μL et gel de matrice de 33 %. Cellules épithéliales de la plaque sur le dessus de couches de base à l’aide de 100 μL de mélange de 33 % matrice gel/cellules / puits.Remarque : Les expériences antérieures ont démontré que la semis trop dense en 3D, les cellules épithéliales limitera la taille de croissance organoïde, tandis que les semis trop faiblement peuvent entraîner la très faible rendement,13. Il est important d’optimiser les conditions de semis pour le type de cellule d’intérêt, basé sur l’efficacité de la formation spécifique au patient organoïde. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 à 45 min permettre le gel de la matrice se solidifier, puis doucement ajouter 100 μL de médias organoïde axée sur les KSFM sur le dessus de cellules en pipettant également lentement contre le bord du puits. Modifier les médias tous les 2 – 3 jours. Pipetage contre la paroi du puits avec un espace entre le médias et matrice gel, retirez soigneusement 50 μL de médias et remplacer par 50 μL de supports neufs.Remarque : Pour une culture à long terme, le gel de la matrice doit être changé toutes les 2 – 3 semaines. Si la culture de gel de matrice apparaît instable et affiche des rides translucides sous le microscope, puis le gel de la matrice est en panne et doit être remplacé. 2. collection d’Organoïdes de matrice Gel NOTE : Collecte d’organoïdes est nécessaire pour la matrice gel de changements, de passage ou de points de terminaison de l’extraction de l’ARN, l’extraction d’ADN, extraction de protéine et cytométrie en flux. Protéase neutre chaud et Hanks balanced solution saline (HBSS) dans un bain-marie à 37 ° C. Enlevez soigneusement média puits sans perturber le gel de la matrice. Ajouter ~ 200 μL de protéase neutre dans chaque puits à un ~ 1:2 ratio de protéase de matrice gel : neutre et incuber pendant 20 min à 37 ° C. Mécaniquement de dissocier le mélange de protéase matrice gel : neutre par pipetage de haut en bas. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. Transvaser le mélange de gel électrolyte de matrice protéase neutre dans un tube de microcentrifuge ou tube à fond conique, en fonction du volume. Centrifuger à 300 g pendant 3 – 5 min granuler des cellules.Remarque : Si aucun culot cellulaire n’apparaît, le gel de la matrice ne peut-être pas être complètement dissocié et peut être visualisé comme une phase translucide au fond du tube distinct du surnageant rose. Retirez le surnageant et ajouter protéase plus neutre à un ratio de 1:2 à matrice le culot de gel, incuber pendant 20 à 40 min à 37 ° C et répéter la centrifugation à 300 x g. Lorsqu’un pellet organoïde est acquis, éliminer le surnageant. Poursuivez le passage (voir étape 2.7.1), organoïde lyse pour l’extraction de l’ARN, ADN ou protéines (voir étape 2.7.2), unique de traitement des cellules par cytométrie en flux et le séquençage des unicellulaires (voir étape 2.7.3). Pour les cultures à long terme, doucement resuspendre organoïdes intact dans 33 % frais de matrice gel et plaque en suivant les étapes décrites dans les étapes 1.1 – 1,5. Pour dissocier des organoïdes et replate comme des cellules individuelles, resuspendre le culot dans 1 mL d’enzymes chaud-la dissociation cellulaire et incuber à 37 ° C pendant 10 à 15 min, laver une fois avec 5 mL de HBSS et re-plaque dans le gel frais matrice suivant étapes 1.1 – 1,5. Resuspendre le culot d’organoïde dans un tampon de lyse approprié pour l’extraction de l’ARN, l’extraction d’ADN ou l’extraction de protéines telles qu’énumérées dans le Tableau des matériaux et suivre le protocole du fabricant. Resuspendre organoïdes dans 1 mL d’enzymes chaud-la dissociation cellulaire et incuber à 37 ° C pendant 10 à 15 min à se dissocier de l’organoïdes en cellules individuelles. Laver une fois avec 5 mL de HBSS et aller de l’avant avec le protocole pour écoulement cytometry5 ou unicellulaires séquençage18.Remarque : Pour dissocier dans des cellules individuelles à de faibles concentrations de gel de la matrice, la protéase neutre peut-être ne pas être nécessaires, et enzymes de dissociation cellulaire peuvent être appliquées directement dans le puits après l’étape 2.2. 3. ensemble-bien Image Acquisition et analyse de la morphologie Organoïde Acquérir des images de tout puits z-pile à l’aide d’un microscope inversé lumière transmis avec un motorisé X / Y analyse la scène (workflow illustré dans la Figure 1 a). La position focale réglée au fond du puits, commencez à mise au point vers le haut jusqu’à ce que le premier organoïde est rencontrée, qui sera au centre du puits à cause du ménisque de la couche de base. Définir le plan z bas à cette position. Poursuivre la mise au point vers le haut jusqu’à ce que le dernier organoïde est mise au point, qui sera dans la périphérie du puits. Définir le plan z supérieur à cette position.Remarque : Après avoir réglé le haut et le bas de la pile-z, s’assurer que ces positions capturent l’organoïdes dans tous les puits restants et ajustez le haut/bas, selon vos besoins. Cela permet pour la gamme z à utiliser pour un seul balayage qui inclut chaque organoïde dans chaque puits. Capturer les 15 – 35 z-plans / puits, en utilisant un plus grand nombre pour une plus grande résolution. Capturer l’image bien ensemble, fusionner et recueillir les quadrants ou paragraphes si nécessaire.Remarque : Il est recommandé de prendre plusieurs avions-z par opposition à un seul plan z, comme l’illustre l’ Figure 1 b , dans lequel organoïdes sont hors de discussion lors de la capture d’un seul plan z. Enregistrer des images de z-pile pour analyse en aval. Analyser les images à l’aide de logiciel d’images avec des possibilités de dessin libres. Ouvrez une seule image de z-plane définie à l’étape 3.1.4. Si nécessaire, les images prises à chaque plan z individuel dans une seule image puits ensemble de tuiles. Enregistrez la nouvelle image dans un fichier séparé. Répétez cette procédure pour chaque plan z acquis. À l’aide du logiciel image, ouvrez l’image de tout puits pour chaque plan z provenant d’un puits unique et créer une profondeur de champ (Fed) image étendue de la pile de z-planes.NOTE : Ce type d’image choisira la meilleure région de mise au point de chaque plan z pour créer une seule image de mise au point du puits. Définir l’échelle du pixel du logiciel au Barreau de l’échelle de l’image qui est mesurée. À l’aide de l’outil forme libre et dessin du logiciel image, trace le périmètre de chaque organoïde dans le puits. Obtenir la métrique de mesure de périmètres organoïde tracées par le logiciel d’image.Remarque : Les paramètres recommandés sont zone, circularité et rapport rayon maximale/minimale. Résultats représentatifs qui illustrent l’application de ces mesures sont indiquées dans la Figure 1. Zone est calculé à partir du polygone défini par le périmètre de l’organoïde. La circularité est le rapport entre la zone de l’organoïde à l’aire d’un cercle avec furet maximale un diamètre l’organoïde d’equal, où 0 est moins circulaires et 1 plus circulaire. Maxi/mini rayon ratio est le rapport entre le rayon maximum et le rayon minimal de l’organoïde tracée.Circularité =Rapport rayon = 4. paraffine et Fixation au formol incorporation d’Organoïdes pour les paramètres histologiques Préparer les fournitures encastrement : HBSS, solution d’agar de 2 %, colorant histologique marquage, gel d’histologie, de pipettes moule d’embout, ruban, piston d’une seringue à insuline de 1 cc, banquise, cassettes, 10 % de formol tamponné neutre (FBN), un crayon et 75 % grade histologique d’éthanol (EtOH). Préparer deux tubes de microcentrifuge de solution d’agar de 2 %. Incuber dans un bain-marie ou dans un bloc chauffant à 100-110 ° C pour maintenir la gélose sous forme liquide. Ajouter 1 à 2 gouttes de histologique marquant le colorant à l’une des solutions de 2 % d’agar, qui signifiera la partie supérieure de la gélose Branchez et aident au maintien de l’orientation au cours de l’incorporation. Bien mélanger. Chauffer le gel de l’histologie dans un bloc de baignoire ou de la chaleur de l’eau à 55-65 ° C. À l’aide d’une pointe de pipette 1000 μL, créer des moules en découpant une petite section de l’embout de la pipette pour faire un cylindre qui contient environ 50 μL. Créer un moule ensuite, plus large qui s’adapte autour du premier moule. Créez un bloc froid en encapsulant un sac de glace avec du ruban adhésif (adhésif vers le haut) et en respectant les moules sur la bande. Créer un plongeur en retirant le piston d’une seringue à insuline de 1 cc. Incorporer l’organoïdes dans une prise de gel d’histologie pour traitement, suivant le flux de travail représenté dans la Figure 2 a. Dissocier le gel de la matrice et pellet organoïdes en suivant les étapes 2.1 – 2,7. Laver le culot organoïde une fois avec 1 mL de HBSS et re-granulés en filature pendant 3 à 5 min à 300 x g et en supprimant le surnageant. Resuspendre le culot d’organoïde dans 30 à 50 μL de gel liquide histologie. Mélanger doucement en pipettant également monter et descendre lentement. Transférer le mélange de gel/organoïde histologie dans un moule sur le bloc froid et laisser l’échantillon de refroidir et se solidifier dans un bouchon. Utiliser un piston pour pousser le bouchon sur le petit moule et dans le plus grand moule. Pipetter clair 2 % d’agar autour du bouchon pour remplir le moule plus grand. Pipette histologique teinté de colorant 2 % d’agar sur le dessus du bouchon pour désigner la partie supérieure de l’échantillon. Une fois refroidie, utiliser un piston pour transférer la fiche dans une cassette de l’histologie. Étiquetez la cassette à l’aide d’une cassette de crayon et place dans 10 % NBF pour la fixation du jour au lendemain. Transférer la cassette de 10 % NBF au grade histologique 70 % EtOH. Processus le gel histologie fiche utilisant un protocole de biopsie réglée sur un processeur, si elles sont disponibles. Si le paramètre prédéfini n’est pas disponible, saisir la séquence et les longueurs suivantes : 70 % EtOH pendant 6 min, 70 % EtOH pour 10 min, 80 % EtOH pendant 10 min, 95 % EtOH 2 fois pendant 10 min, 100 % EtOH 3 fois pendant 10 min, xylène 3 fois pendant 15 min , et en paraffine 3 fois pendant 15 min. s’écartant de la recommandée séquence de traitement peut entraîner la rupture organoïdes (Figure 3 a). Incorporer la prise de gel d’histologie avec la partie colorée vers le haut, ce qui permettra à la partie décolorée qui contient l’organoïdes à être sectionné en premier. Article l’histologie FFIP gel blocs : Matériel nécessaire : histologie FFIP gel stylo histologie, bain d’eau flotteur tissu, blocs, seau à glace avec glace, microtome, lames microtome, incorporation de poste de travail, chargés positivement les lames de microscope et four de laboratoire. Bain d’eau de remplissage jusqu’à ce que très complet et réglé à 40 ° C, puis four de laboratoire préchauffez à 45 – 50 ° C. Préparer un seau à glace, puis remplir de glace et ajouter de l’eau pour créer une suspension d’eau glacée. Faites refroidir les blocs de glace jusqu’à ce qu’ils sont très froids.NOTE : Blocs peuvent être définies sur la glace pour jusqu’à 1 jour, mais si laissé toute la nuit, les blocs vont devenir hydratés et devront être retraitées. Insérer un bloc de serrage de cassette microtome, s’ajoute la lame du porte-couteau et débloquer toutes mesures conservatoires de verrouillage sur l’ordinateur. Commencer par couper le visage du bloc de paraffine (face) sur une épaisseur de 10 µm. Une fois une section émerge qui contient la zone de prise, arrêter de parage, bloquer le rotor microtome et transférer le bloc sur la glace pour refroidir. Si plusieurs blocs doivent être sectionnées, face à face chaque bloc avant de passer à l’étape 4.5.6. Déplacez la lame à une portion de neuf, inutilisée et transférer le bloc à la pince. Débloquer la machine et commencer à tailler à 5 μm par section.Remarque : 5 μm est recommandé pour de meilleurs résultats, mais 3 – 10 μm est également acceptable. À l’aide de pinces à épiler, transférer la section dans le bain d’eau de 40 ° C et laisser la section d’étaler. Transférer la section sur une lame en plongeant verticalement dans l’eau.NOTE : Trempage dans un angle peut transférer les bulles du fond de la baignoire à la section et entraîner une distorsion de l’échantillon. Visualiser la section sous microscope (Figure 2 bC).Remarque : Si un organoïde présents, il sera identique à la flèche rouge dans la Figure 2 b. Bulles (Figure 2 b, flèche bleue) peuvent apparaître semblables à organoïdes et sont plus faciles à discerner dans une diapositive-frais que secs organoïdes apparaissent translucide (Figure 2). Si aucun organoïdes ne sont présents, section plus loin dans le bloc. Lorsque les diapositives contenant organoïdes ont été acquis, entourez la zone autour de la section sur le dos de la lame avec un stylo de l’histologie et les cuire au four durant la nuit à 45 – 50 ° C. Recueillir des diapositives et de procéder à la H & E (voir l’étape 4.9.1), immunohistochimiques (voir étape 4.9.2), ou par immunofluorescence souillant (voir étape 5).NOTE : Résultats représentatifs sont montrées dans la Figure 3 b. Pour effectuer des H & E coloration, obtenir un kit de la liste du matériel et suivez les indications du fabricant. Pour effectuer le marquage immunohistochimique, obtenir un kit et un anticorps primaire dans la liste de matériaux et suivre les indications du fabricant. 5. immunofluorescence de FFIP et sectionnés Organoïdes Matériel : au four slide de l’étape 4, xylène, 100 % EtOH, 95 % EtOH, 70 % EtOH, eau désionisée (DI H2O), coplin jars, 1 x antigène retrieval solution (tampon citrate de sodium ou tampon Tris-EDTA), tamponnée au phosphate solution saline (PBS), 5 % cheval normal sérum ( NHS) avec un détergent non ionique 0,1 % dans du PBS, 1 % sérum d’albumine bovine (BSA) avec un détergent non ionique 0,3 % dans du PBS, rack de coloration, coloration plat, révèler chambre, stylo barrière hydrophobe, chambre humide, 1 ° et anticorps 2 ° d’intérêt et de recouvrement des intérêt. Déparaffiner et réhydrater les diapositives en plongeant dans les coplins remplis avec les solutions suivantes : xylène (3 trempettes, 5 min chacun), 100 % EtOH (2 trempettes, 3 min chacun), 95 % EtOH (2 trempettes, 3 min), 70 % EtOH (2 trempettes, 3 min) et DI H2O (2 trempettes 3 min chacun). Remplir le plat coloration avec la solution de l’antigène et la chambre de préchauffage révèler à 100 ° C. Effectuer la recherche d’antigène en immergeant les lames dans le plat de coloration préchauffé et incuber pendant 5 à 10 min à 100 ° C. Une fois le cycle terminé, laisser la chambre decloaking siéger pendant 20 min avant d’ouvrir le couvercle. Une fois que le plat de la lame est refroidie jusqu’à la RT, posez le plat coloration courante DI H2O à rincer les lames pendant 5 min. Supprimer les diapositives de la coloration plat, tracer un cercle autour de l’échantillon avec un stylo de barrière hydrophobe et poser la lame sur la chambre de l’humidité. Bloquer n’importe quel anticorps non-spécifiques coloration en appliquant le NHS de 5 % avec un détergent non ionique 0,1 % dans du PBS au cercle hydrophobe autour de l’échantillon (environ 30 μL est nécessaire pour couvrir l’échantillon). Diapositives de lavage de coplins remplis de PBS 3 fois pendant 5 min chaque. Ajouter les anticorps 1° (Table des matières) dilués à 1 % de BSA avec 0,3 % de détergent non ionique dans du PBS au cercle hydrophobe autour de l’échantillon (environ 30 μL devrait couvrir la section), puis incuber pendant 1 heure à ta ou toute la nuit à 4 ° C en chambre humide. Laver les diapositives dans coplins rempli de PBS 3 fois pendant 5 min chaque. Ajouter l’anticorps 2° dilué à 1 % de BSA avec 0,3 % de détergent non ionique dans du PBS au cercle hydrophobe autour de l’échantillon (environ 30 μL couvrira la surface), puis incuber pendant 1 heure à ta en chambre humide. Laver les diapositives dans coplin rempli de PBS 3 fois pendant 5 min chaque. Ajouter DAPI, dilué selon les spécifications du fabricant, dans 1 % BSA avec 0,3 % de détergent non ionique dans du PBS au cercle hydrophobe autour de l’échantillon, puis incuber pendant 2 à 5 min à ta dans l’obscurité (30 μL). Laver les diapositives dans coplins rempli de PBS 3 fois pendant 5 min chaque. Monter les lames avec des supports de montage antifade et lamelle, puis visualiser les résultats sous un microscope. 6. montage ensemble d’Organoïdes pour immunofluorescence Matériel : diapositive de chambre ou plat confocale, tampon phosphate salin (PBS), fixateur, 50 mM NH4Cl dans du PBS, 0,1 % de détergent non ionique dans du PBS, NHS de 5 % avec un détergent non ionique 0,1 % dans du PBS, 1 % de BSA avec 0,3 % de détergent non ionique anticorps PBS, 1 ° et 2 ° d’intérêt et colorants d’intérêt. Retirez soigneusement autant médias possible sans perturber la culture organoïde en pipettant également contre la paroi du puits, laissant l’espace entre les médias et la matrice gel. En utilisant un parés, pré mouillage avec les médias ou PBS, 1 000 de pipette μL, dresser une goutte (25 – 50 μL) de gel de matrice qui contient l’organoid(s) d’intérêt et répartir au milieu d’un plat bien ou confocale du chambre de diapositive.Remarque : 33 % matrice gel n’est pas un solide. C’est un liquide gélatineux qui gère semblable à une gelée qui n’a pas été défini entièrement. Un embout de la pipette taillée avec une large ouverture empêchera organoïdes de rupture pendant les transferts. Si les organoïdes restent dans la culture parente, remplacez médias médias KSFM chaud. Avec l’oeil nu ou de dissection, aspirez le gel excès de médias et de la matrice de la diapositive de chambre avec une pipette de fine pointe (10 – 200 μL).Remarque : Il est facultatif d’un prétraitement de la diapositive de chambre avec un réactif d’adhérence. Plaque d’un volume égal de matrice gel dans un puits vide de la diapositive de la chambre comme un contrôle facultatif d’observer l’autofluorescence des reste matrice. Placez la chambre dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 à 45 min promouvoir l’organoïde pour adhérer à la vitre et éviter toute perte d’échantillons au cours des étapes de lavage. Pipetage lentement pour éviter de détachement de diapositive, laver organoïdes avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min à ta tout en secouant doucement. Enlever le 1 x PBS et fix avec 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min à ta tout en secouant doucement. Veiller à ce que le gel de la matrice apparaît clairement après cette étape.Remarque : La fixation méthanol ou formol sont également possibles. Méthode de fixation doit être optimisée pour des anticorps spécifiques, comme certaines méthodes de fixation peuvent relier les antigènes d’intérêt ou étancher fluorescentes-étiquetage-protéines d’intérêt. Retirez le fixateur et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement.Remarque : La longueur des étapes de lavage doit être optimisée selon la taille d’organoïde. Cinq minutes est un point de départ suffisant, mais l’étape de lavage peut être prolongée si nécessaire. Étancher autofluorescence avec 200 μL de 50 mM NH4Cl dans du PBS 1 x pendant 30 min à ta tout en secouant doucement.Remarque : Cette étape va étancher autofluorescence des débris dans le lumen de l’organoïde et d’expression de la protéine fluorescente (tels que GFP) qui peut-être présenter de plan expérimental. Il devrait être inclus s’il est nécessaire d’utiliser un fluorophore dans le chenal 488 mais peut être ignorée si vous le souhaitez afin de préserver le signal de la GFP. Enlevez NH4Cl et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement. Permeabilize organoïdes dans 200 μl de 0,1 % de détergent non ionique-100 dans du PBS 1 x pendant 30 min à ta tout en secouant doucement. Enlever le détergent non ionique 0,1 %-100 en 1 x PBS et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement. Bloquer avec 5 % NHS avec 200 μL de 0,1 % de détergent non ionique X-100 dans du PBS et incuber pendant 60 min à ta tout en secouant doucement. Retirer le tampon de blocage et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement. Diluer l’anticorps 1° 1 % BSA avec 0,3 % Triton X-100 dans du PBS 1 x et ajouter 200 μl de la diapositive de la chambre, puis incuber pendant 1 à 3 jours à 4 ° C. Éliminer les anticorps de la 1° et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement. Diluer l’anticorps 2° 1 % BSA avec 0,3 % Triton X-100 dans du PBS 1 x et ajouter 200 μl de la diapositive de la chambre, puis incuber pendant 1 à 3 jours à 4 ° C dans l’obscurité.Remarque : La longueur du temps d’incubation doit être optimisée pour les anticorps et organoïde taille. Certains exigeront plus de temps pour traverser l’organoïde. Concentration en anticorps devront également être optimisé. En général, 2 x la concentration utilisée pour les sections de la FFPE est appropriée pour les anticorps de la 1° et la même concentration pour les sections de la FFPE est appropriée pour les anticorps 2°. Éliminer les anticorps de la 2° et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement. Contre-coloration l’actine avec la phalloïdine et le noyau avec DAPI ou Hoescht, dilué selon les recommandations du fabricant BSA 1 % 0,3 % Triton-X dans du PBS 1 x. Ajouter 200 μL à glissière de la chambre, puis incuber à RT pendant 40 min dans le noir. Mont de 200 μL de frais 1 x PBS ou supports de montage et image immédiatement (fluorescence devrait être conservé pendant 5 jours, si ce n’est pas plus). Résultats représentatifs sont présentés dans la Figure 3.NOTE : Azide de Sodium peut être ajouté aux échantillons pour prévenir la contamination si l’imagerie confocale n’est pas facilement disponible. Ajout d’un agent de compensation peut améliorer l’imagerie. 7. montage ensemble d’Organoïdes pour des essais et des sondes fluorescentes Remarque : Il existe des tests disponibles dans le commerce et les sondes/colorants fluorescents (exemples figurent sur la liste du matériel) amendable utilisables sur montés ensemble organoïdes d’observer une variété de points de terminaison utile19. Le protocole suivant est pour le kit de prolifération EdU fluorescent marqué, mais n’importe quel kit peut être modifié pour être utilisé avec un échantillon montés ensemble. Soigneusement retirer 50 μL de médias et le remplacer par 50 μL de 20 μM 2 x EdU solution de travail en pipettant également contre la paroi du puits, laissant l’espace entre les médias et la matrice gel. Incuber à 4 ° C pendant 1 à 3 jours (la durée désirée pour l’incorporation de l’EdU doit être optimisée pour le type de cellule de choix). Suivez les étapes de 6,2 à 6,8 pour transférer les organoïdes d’intérêt sur une diapositive de chambre ou plat confocale. Retirer les PBS et fixer avec 200 μL de paraformaldéhyde de 3,7 % pendant 30 min à ta tout en secouant doucement. Faire en sorte que la matrice gel semble clair après cette étape. Retirez le fixateur et laver deux fois avec 200 μl de PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement. Supprimez les PBS et 200 μl de 0,5 % de détergent non ionique-100 dans 1 x PBS pendant 30 min à ta tout en secouant doucement. Préparer un 1 x fluorescente réaction cocktail selon les spécifications du fabricant. Retirez 0,5 % de détergent non ionique-100 et laver deux fois avec 200 μl de 3 % de BSA dans du PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement. Ajouter réaction cocktail et incuber 30 min à ta dans l’obscurité. Supprimer la réaction fluorescente cocktail et laver une fois avec 200 μl de 3 % de BSA dans du PBS 1 x pendant 5 min en secouant doucement. Contre-colorant et monter en suivant les étapes 6.21 – 6.22 (Figure 3D).