Behandeling en evaluatie van menselijke primaire prostaat Organoid cultuur

Het volgende protocol was geoptimaliseerd door het gebruik van menselijke primaire prostaat epitheliale cellen geoogst uit weefsel van de patiënt aan de Universiteit van Illinois in Chicago ziekenhuis. Alle menselijke weefsels gebruikte voor deze experimenten werden verworven via een institutionele Review Board-goedgekeurde protocol en/of vrijstelling aan de Universiteit van Illinois te Chicago. Hoewel de kweekomstandigheden afhankelijk van het celtype van belang variëren zal, kunnen de eindpunten worden toegepast op organoids van andere weefsels. 1. het zaaien van epitheliale cellen in de Matrix Gel en het veranderen van de Media Verzamelen van de benodigde materialen: menselijke primaire prostaat epitheliale cellen (PrE), matrix gel op ijs, 96-Wells microplate, Keratinocyt serumvrij media (KSFM) op het ijs, houtskool gestripte foetale runderserum (FBS) en dihydrotestosteron (DHT). KSFM gebaseerde organoid media te bereiden door het combineren van 47.5 mL KSFM met 2,5 mL houtskool gestripte FBS en dihydrotestosteron (DHT) op een eindconcentratie van 10 nM DHT, dan reserve op ijs. De cellen van de plaat in een 3D matrix in een cel cultuur kap met behulp van steriele techniek. Zachtjes mix koude KSFM gebaseerde organoid media met ijskoude matrix gel op het verkrijgen van een matrix van 50% gel mengsel door langzaam op en neer pipetteren, het vermijden van bubbels.Opmerking: Matrix gel moet worden ontdooid ‘s nachts bij 4 ° C en op ijs waar mogelijk gehouden. Het stolt snel bij kamertemperatuur (RT). Natte vooraf een pipet tip in koude media en overdracht 40 – 50 μl van 50% matrix gel op de bodem van elk putje te worden gebruikt op een 96-wells-plaat. De bodem van de put te vormen een basislaag jas.Opmerking: Niet volledig aan de tweede halte op Pipetteer afzien, aangezien dit tot bubbels leiden kan. Plaats de 96-wells-plaat in 37 ° C incubator voor 30-45 min te stollen de basislaag.Opmerking: Niet epitheliale cellen op de basislaag plaat totdat het is gestold, of cellen kunnen vallen door de matrix op de bodem van de plaat en groeien als een enkelgelaagde. Meng de epitheliale cellen gesuspendeerd in KSFM gebaseerde organoid media met matrix gel om een eindconcentratie van 100 – 1000 cellen/100 μl en 33% matrix gel. De epitheliale cellen van de plaat bovenop basis lagen met 100 μl van 33% matrix gel/cel mengsel per putje.Opmerking: Eerdere experimenten hebben aangetoond dat het zaaien van epitheliale cellen ook dichtbevolkte in 3D de grootte van organoid groei, terwijl ook dun zaaien in zeer lage opbrengst13 resulteren kanzal beperken. Het is belangrijk voor het optimaliseren van de seeding van de voorwaarden voor het celtype van belang, gebaseerd op de organoid van de patiënt-specifieke vorming efficiëntie. Plaats van de 96-wells-plaat in een incubator 37 ° C gedurende 30-45 minuten om de gel van de matrix te stollen, en vervolgens zachtjes 100 μl van KSFM gebaseerde organoid media boven aan cellen toevoegen door pipetteren langzaam tegen de rand van de put. De media elke 2-3 dagen wijzigen. Pipetteren tegen de zijkant van de put met ruimte tussen de media en matrix gel, verwijder voorzichtig 50 μl van media en het vervangen met 50 μl van nieuwe media.Opmerking: Voor een langetermijnkweek, de matrix gel moet worden veranderd elke 2-3 weken. Als de matrix gel cultuur unstable worden weergegeven doorschijnend rimpels onder de Microscoop, dan is de matrix gel heeft afgebroken en moet worden vervangen. 2. verzameling van Organoids uit Matrix Gel Opmerking: Verzameling van organoids is nodig voor matrix gel wijzigingen, passaging of eindpunten van extractie van RNA, DNA-extractie, eiwit extractie en stroom cytometry. Warme neutrale protease en Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) in een waterbad 37 ° C. Verwijder voorzichtig zonder het verstoren van de matrix gel media uit putten. Op een ~ 1 ~ 200 μL van neutrale protease toevoegen aan elk putje: 2 verhouding van matrix gel: neutraal protease en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Mechanisch distantiëren de matrix gel: neutraal protease mengsel door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Het mengsel van de gel-cel neutrale protease-matrix overbrengen in een microcentrifuge buis- of kegelvormig buis, afhankelijk van het volume. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3-5 min naar pellet cellen.Opmerking: Als er geen cel pellet verschijnt, de matrix gel kan niet volledig worden losgekoppeld en kan worden gevisualiseerd als een doorschijnend fase aan de onderkant van de buis van het supernatans dat roze onderscheiden. De bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen op een verhouding van 1:2 neutraler protease aan matrijs de gel pellet, Incubeer gedurende een ander 20-40 minuten bij 37 ° C en herhaal centrifugeren op 300 x g. Wanneer een organoid pellet wordt verworven, verwijder de bovendrijvende substantie. Doorgaan met passaging (zie stap 2.7.1), lysis van de organoid voor de extractie van RNA, DNA of eiwit (zie stap 2.7.2), verwerking enkel cellen door stroom cytometry, en eencellige sequentiebepaling (zie stap 2.7.3). Voor langetermijnkweek, zachtjes resuspendeer intact organoids in 33% vers matrix gel en plaat als volgt beschreven in stap 1.1-1.5. Een keer wassen met 5 mL HBSS te distantiëren van organoids en replate als afzonderlijke cellen, resuspendeer de pellet in 1 mL warme cel-dissociatie enzymen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 à 15 minuten, en opnieuw plaat in de vers matrix gel na stappen 1.1-1.5. Resuspendeer de pellet organoid in een passende lysis-buffermengsel voor extractie van RNA, DNA-extractie of eiwit extractie, zoals vermeld in de Tabel van de materialen en van de fabrikant protocol volgen. Resuspendeer organoids in 1 mL warme cel-dissociatie enzymen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 à 15 minuten te distantiëren van de organoids in afzonderlijke cellen. Een keer wassen met 5 mL HBSS en ga verder met het protocol voor stroom cytometry5 of eencellige sequencing18.Opmerking: Om te distantiëren in afzonderlijke cellen in lage concentraties van matrix gel, de neutrale protease kan niet nodig, en cel-dissociatie enzymen kunnen rechtstreeks worden toegepast op de put na stap 2.2. 3. geheel-well Beeldacquisitie en analyse van de Organoid morfologie Verwerven van geheel-well z-stack beelden met behulp van een doorvallend licht omgekeerde Microscoop met een gemotoriseerde X / Y scannen fase (werkstroom geïllustreerd in figuur 1A). Beginnen gericht omhoog totdat de eerste organoid wordt aangetroffen, die in het midden van de put te wijten aan de meniscus van de basislaag worden zal met het focal standpunt aangepast aan de bodem van de put. Stel de onderkant z-plane op deze positie. Blijven richten omhoog totdat de laatste organoid is in beeld, die in de periferie van de put worden zal. Stel de hoogste z-plane op deze positie.Opmerking: Na het instellen van de boven- en onderkant van de z-stack, zorg ervoor dat deze standpunten de organoids binnen alle resterende putjes vangen en pas desgewenst aan de bovenkant/onderkant. Dit zorgt voor het z-bereik dat moet worden gebruikt voor een enkele scan waarin elke organoid binnen elk putje. 15 – 35 z-vliegtuigen per putje, met behulp van een groter getal voor grotere resolutie vastleggen. De hele goed beeld vastleggen, samenvoegen en verzamelen kwadranten of subsecties indien nodig.Opmerking: Het wordt aanbevolen om meerdere z-vliegtuigen in tegenstelling tot een honkslag z-plane, zoals geïllustreerd in figuur 1B waarin organoids onscherp worden bij het vastleggen van slechts één z-plane. Z-stapel afbeeldingen voor downstream analyse opslaan. Analyseren van beelden met behulp van beeld software met vrije tekenmogelijkheden. Open één afbeelding z-plane instellen vanuit stap 3.1.4. Indien nodig, de foto’s genomen op elke individuele z-plane in één geheel-well afbeelding tegel. De nieuwe afbeelding als een afzonderlijk bestand opslaan. Herhaal dit proces voor elke z-plane verworven. Open de afbeelding geheel-well voor elke z-plane uit een enkele bron met beeld software en maken een uitgebreide diepte van gebied (EOF) beeld van de stack van z-vliegtuigen.Opmerking: Dit type afbeelding selecteert de beste focus regio van elke z-vliegtuig naar het maken van een enkel beeld in-focus van de put. Stel de schaal van de pixel van de software aan de bar van de schaal van de afbeelding die wordt gemeten. Met behulp van het gereedschap Vrije vorm tekenen van de afbeelding software, traceren de omtrek van elke organoid in de put. De meting statistieken voor overgetrokken organoid planimetrische weergave van de afbeelding software verkrijgen.Opmerking: Aanbevolen parameters zijn gebied, cirkelvormigheid en maximale/minimale radius-verhouding. Representatieve resultaten ter illustratie van de toepassing van deze statistieken worden weergegeven in Figuur 1 c. Gebied is berekend op basis van de veelhoek gedefinieerd door de organoid de omtrek. Cirkelvormigheid is de verhouding van de ruimte van de organoid aan de oppervlakte van een cirkel met een diameter gelijk de organoid de maximale ferret, waarbij 0 is minder circulaire en 1 meer circulaire. Maximale/minimale radius-ratio is de verhouding tussen de maximumstraal en de minimumboogstraal voor de getraceerde organoid.Cirkelvormigheid =RADIUS-verhouding = 4. formaline fixatie en paraffine inbedding van Organoids voor histologisch eindpunten Bereiden van insluiten leveringen: HBSS, 2% agar-oplossing, histologisch markering kleurstof, histologie gel, Pipetteer tip schimmel, tape, plunjer uit een 1 cc insuline spuit, ice pack, cassettes, 10% neutraal gebufferde formaline (NBF), potlood en 75% histologisch graad ethanol (EtOH). Twee microcentrifuge-buizen van 2% agar-oplossing te bereiden. Incubeer in een waterbad of op een warmte blok bij 100-110 ° C te handhaven agar in vloeibare vorm. Voeg 1-2 druppels histologische markering kleurstof aan één van de 2% agar-oplossingen, die zal het duiden van de bovenkant van de agar sluit en helpen bij het handhaven van oriëntatie tijdens het insluiten. Meng goed. Warm de histologie gel in een water-bad of warmte blok bij 55-65 ° C. Maak met een 1000 μL pipet tip mallen door te snijden een klein deel van het uiteinde van de pipet om een cilinder die in het bezit van ~ 50 μl. Maak een tweede, bredere schimmel die rond de eerste mal past. Maak een koud blok door verpakking van een pak ijs met tape (klevende kant naar boven) en mallen aan de tape vast te houden. Maak een plunjer doordat de zuiger van een 1 cc insuline spuit. De organoids insluiten in een histologie gel plug voor verwerking, volgen de workflow die is afgebeeld in figuur 2A. Distantiëren van de matrix-gel- and -pellet organoids door het volgen van de stappen 2.1-2.7. De organoid pellet een keer met 1 mL HBSS en opnieuw pellet wassen door spinnen gedurende 3-5 min. 300 x g en de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Resuspendeer de pellet organoid in 30 – 50 μl van vloeibare histologie gel. Meng zachtjes door pipetteren langzaam op en neer. Breng de histologie gel/organoid mengsel in een mal op het koude blok en laat het specimen afkoelen en stollen in een stekker. Gebruik een zuiger te duwen de stekker uit de kleine schimmel en in de grotere mal. Pipetteer duidelijk 2% agar rond de stekker te vullen van de grotere schimmel. Pipetteer histologische kleurstof getinte 2% agar bovenop de stekker ter aanduiding van de bovenkant van het monster. Eenmaal afgekoeld, kunt een plunjer Breng de stekker in een cassette histologie. De cassette met behulp van een potlood en plaats de cassette in 10% label NBF voor fixatie ‘s nachts. Overzetten van de cassette van 10% naar 70% histologisch graad EtOH NBF. Proces de histologie gel sluit met behulp van een vooraf ingestelde biopsie-protocol op een processor, indien beschikbaar. Als voorinstelling niet beschikbaar is, voer de volgende sequentie en lengtes: 70% EtOH voor 6 min, 70% EtOH voor 10 min 80% EtOH voor 10 min, 95% EtOH 2 keer voor 10 min, 100% EtOH 3 keer voor 10 min, xyleen 3 keer voor 15 min , en paraffine 3 keer voor 15 min. die afwijkt van de aanbevolen volgorde verwerken kan leiden tot gescheurde organoids (figuur 3A). Embed de histologie gel stekker met het gekleurde gedeelte naar boven, aangezien hierdoor de verkleurd gedeelte met de organoids te worden gesegmenteerd in eerste. Sectie de histologie FFPE gel blokken: Verzamelen van noodzakelijke levering: FFPE histologie gel blokken, histologie pen, weefsel float waterbad, ijsemmer met ijs, microtome, microtome messen, werkstation, positief geladen Microscoop dia’s en laboratorium oven te embedding. Opvulling waterbad tot zeer volledige en ingesteld op 40 ° C, dan vooraf warm laboratorium oven tot 45-50 ° C. Bereiden van een ijsemmer, dan vullen met ijs en voeg water tot een ijswater drijfmest. Chill de blokken op ijs totdat zij zeer koud zijn.Opmerking: Blokken kunnen worden ingesteld in de ijskast voor tot 1 dag, maar als ‘s nachts verliet de blokken zullen worden gehydrateerd en zal moeten worden verwerkt. Een blok invoegen microtoom cassette klem, toevoegen van het blad aan de meshouder en ontgrendelen van de vergrendeling beschermende maatregelen op de machine. Beginnen door te korten op het gezicht van het blok van de paraffine (geconfronteerd af) bij een dikte van 10 µm. Zodra een sectie dat de plug gebied bevat blijkt, stop trimmen, vergrendelen van de microtoom rotor en overbrengen van het blok weer terug op het ijs om te relaxen. Als meerdere blokken worden gesegmenteerd, face-off elke blokkeren voordat u naar stap 4.5.6. Het blad naar een nieuwe, ongebruikte gedeelte en het blok ook terug overzetten naar de klem. Ontgrendelen van de machine en trimmen op 5 μm per sectie beginnen.Opmerking: 5 μm wordt aanbevolen voor de beste resultaten, maar 3 – 10 μm is eveneens aanvaardbaar. Met pincet, de sectie overbrengen in het waterbad van 40 ° C en laat de sectie te spreiden. Overdracht van de sectie op een dia door dompelen verticaal in het water.Opmerking: Dompelen in een hoek kunnen luchtbellen uit de bodem van het bad overbrengen in de sectie en vervorming van het monster veroorzaken. Visualiseer het gedeelte onder de Microscoop (figuur 2BC).Opmerking: Als een organoid aanwezig is, wordt deze weergegeven vergelijkbaar met de rode pijl in figuur 2B. Bubbels (figuur 2B, blauwe pijl) vergelijkbaar met organoids kunnen verschijnen en zijn gemakkelijker te onderscheiden op een vers-dia, zoals droge organoids doorschijnend (figuur 2C verschijnen). Als geen organoids presenteren, sectie verder in het blok. Wanneer dia’s met organoids hebben verkregen, cirkel het gebied rond de sectie op de achterkant van de dia met een pen van histologie en bak ‘s nachts bij 45-50 ° C. Verzamelen van dia’s en gaat u verder met H & E (zie stap 4.9.1), immunohistochemische (zie stap 4.9.2), of immunefluorescentie kleuring (zie stap 5).Opmerking: Representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 3B. Voor het uitvoeren van de H & E kleuring, een kit verkrijgen in de materialen lijst en volg de instructies van de fabrikant. Standaardinteracties immunohistochemische kleuring, een kit en primair antilichaam te verkrijgen van de lijst van de materialen en volg de instructies van de fabrikant. 5. immunefluorescentie kleuring van FFPE en verdeelde Organoids Verzamelen van leveringen: gebakken dia uit stap 4, xyleen, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, gedeïoniseerd water (DI H2O), coplin potten, 1 x antigeen herwinning oplossing (Natriumcitraat buffer of EDTA-Tris buffer), fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 5% normaal paard serum () NHS) met 0,1% niet-Ionische detergent in PBS, 1% bovien serumalbumine (BSA) met de niet-Ionische detergent 0,3% in PBS, kleuring rek, kleuring schotel, kamer, hydrofobe barrière pen, vochtigheid kamer, 1 ° en 2 ° antilichamen van belang, en counterstains van decloaking belang. Deparaffinize en hydrateren van de dia’s door dompelen in coplins gevuld met de volgende oplossingen: xyleen (3 dips, 5 minuten elk), 100% EtOH (2 dips, 3 minuten elk), 95% EtOH (2 dips, 3 minuten elk), 70% EtOH (2 dips, 3 min elke) en DI H2O (2 dips 3 minuten elk). Vul de kleuring schotel met de oplossing van de gegevensherwinning van antigeen en pre warmte decloaking kamer tot 100 ° C. Het uitvoeren van antigeen ophalen door dia’s in de voorverwarmde kleuring schotel onder te dompelen en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 100 ° C. Zodra de cyclus voltooid is, kunt u de decloaking kamer zitten voor 20 min voordat het deksel te openen. Zodra de dia schotel heeft gekoeld aan RT, zet de kleuring schotel onder stromend DI H2O te spoelen van de dia’s gedurende 5 minuten. De dia’s te verwijderen van de kleuring schotel, tekent een cirkel rond het monster met een hydrofobe barrière-pen, en leggen de dia op de kamer vochtigheid. Blokkeren van een niet-specifieke antilichaam kleuring door 5% NHS met 0,1% niet-Ionische detergent in PBS op de hydrofobe cirkel rond het monster toe te passen (ongeveer 30 μL nodig is ter dekking van het monster). Wash dia’s in coplins gevuld met PBS 3 keer voor elke 5 min. Toevoegen van de 1° antilichamen (Tabel of Materials) verdund in 1% BSA met 0,3% niet-ionogene wasmiddel in PBS naar de hydrofobe cirkel rond het monster (ongeveer 30 μL moet betrekking hebben op de sectie), vervolgens Incubeer gedurende 1 h op RT of ‘s nachts bij 4 ° C in de kamer vochtigheid. Het wassen van de dia’s in coplins gevuld met PBS 3 keer voor elke 5 min. Toevoegen van het antilichaam van de 2° verdund in 1% BSA met 0,3% niet-ionogene wasmiddel in PBS naar de hydrofobe cirkel rond het monster (ongeveer 30 μL zal bestrijken het gebied), vervolgens Incubeer gedurende 1 h bij RT in vochtigheid kamer. Het wassen van de dia’s in coplin gevuld met PBS 3 keer voor elke 5 min. DAPI, verdund tot de specificaties van de fabrikant, in 1% BSA met 0,3% niet-ionogene wasmiddel in PBS naar de hydrofobe cirkel rond het monster, voeg dan Incubeer gedurende 2 – 5 min op RT in het donker (30 μL). Het wassen van de dia’s in coplins gevuld met PBS 3 keer voor elke 5 min. De dia’s met antifade montage media en dekglaasje aan mount en visualiseren van de resultaten onder een microscoop. 6. geheel-montage van Organoids voor immunefluorescentie kleuring Verzamelen van leveringen: kamer dia of confocal schotel, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), kleefpoeders, 50 mM NH4Cl in PBS, 0,1% niet-ionogene wasmiddel in PBS, 5% NHS met 0,1% niet-Ionische detergent in PBS, 1% BSA met 0,3% niet-Ionische detergent in PBS, 1 ° en 2 ° antilichamen van belang, en counterstains van belang. Verwijder voorzichtig zoveel media mogelijk zonder het verstoren van de organoid cultuur door pipetteren tegen de zijkant van goed, verlaten ruimte tussen media en matrix gel. Met behulp van een bijgesneden, vooraf nat met media of PBS, 1.000 μL pipet tip, één druppel (25-50 μl) van matrix gel waarin de organoid(s) van belang opstellen en afzien op het midden van een kamer dia goed of confocal schotel.Opmerking: 33% matrix gel is niet een vaste stof. Het is een gelatine-achtige vloeistof die verwerkt vergelijkbaar met een Jello die niet volledig ingesteld. Een tip van de bijgesneden Pipetteer met een grote opening zal breken tijdens overdrachten organoids verhinderen. Als organoids in de bovenliggende cultuur blijven, vervangt u media met warme KSFM gebaseerde media. Gecombineerd met het blote oog of ontleden toepassingsgebied, de overtollige media en matrix gel van de dia van de kamer met een boete-tip Pipet (10-200 μl).Opmerking: Het is optioneel voorbehandeling van de dia van de kamer met een hechting reagens. Plaat een gelijk volume matrix gel in een lege putje van de kamer dia als een optioneel besturingselement te observeren autofluorescence van overgebleven matrix. Plaats de kamer dia in een incubator 37 ° C gedurende 30-45 minuten ter bevordering van de organoid om te voldoen aan het glas en verlies van monsters tijdens wassen stappen te voorkomen. Pipetteren langzaam te voorkomen van onthechting van de dia, organoids met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen op RT terwijl het zachtjes te schudden. Verwijder de 1 x PBS en correctie met 200 μL van 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten op RT terwijl het zachtjes te schudden. Controleer of de matrix gel wordt duidelijk na deze stap weergegeven.Opmerking: Methanol of formaline fixatie zijn ook mogelijk. Fixatie methode moet worden geoptimaliseerd voor specifieke antilichamen, zoals bepaalde fixatie methoden wel dwarslijn de antigenen van belang of quench TL-labeling-proteïnen van belang. Verwijder de fixeer en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden.Opmerking: De lengte van de stappen wassen moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van de grootte van de organoid. Vijf minuten is voldoende uitgangspunt, maar de stap wassen kan zo nodig worden verlengd. Doven autofluorescence met 200 μL van 50 mM NH4Cl in 1 x PBS voor 30 min op RT terwijl het zachtjes te schudden.Opmerking: Deze stap zal autofluorescence uit puin in het lumen van de organoid en fluorescerende eiwit expressie (zoals GFP), die van de proefopzet inhouden kan doven. Het moet worden opgenomen als het gewenst is te gebruiken van een fluorophore in de 488 kanaal, maar kan worden overgeslagen als wilde behouden GFP signaal. Verwijder NH4Cl en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden. Permeabilize organoids in 200 μL van 0,1% niet-ionogene wasmiddel-100 in 1 x PBS voor 30 min op RT terwijl het zachtjes te schudden. Verwijder de 0,1% niet-ionogene wasmiddel-100 in 1 x PBS en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden. Blok met 5% NHS met 200 μL van 0,1% niet-ionogene detergens X-100 op PBS en incubeer gedurende 60 minuten op RT terwijl het zachtjes te schudden. Verwijder de buffer met blokkerend en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden. Verdun het 1° antilichaam in 1% BSA met 0,3% Triton X-100 in 1 x PBS en aan 200 μL van de kamer dia toevoegen en incubeer gedurende 1 tot 3 dagen bij 4 ° C. Verwijderen van het 1° antilichaam en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden. Verdun het 2° antilichaam in 1% BSA met 0,3% Triton X-100 in 1 x PBS en aan 200 μL van de kamer dia toevoegen en incubeer gedurende 1 tot 3 dagen bij 4 ° C in het donker.Opmerking: De duur van incubatie tijd moet worden geoptimaliseerd voor de grootte van de organoid en antilichaam. Sommigen zullen vereisen meer tijd om door te dringen door middel van de organoid. Antilichaam concentratie zal ook moeten worden geoptimaliseerd. In het algemeen, 2 x de concentratie gebruikt voor FFPE secties is geschikt voor 1° antilichamen en dezelfde concentratie voor FFPE secties is geschikt voor 2° antilichamen. Verwijderen van het 2° antilichaam en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden. Counterstain de actine met phalloidin en de kern met DAPI of Hoescht, volgens de aanbevelingen van de fabrikant in 1% BSA met 0,3% verdund Triton-X in 1 x PBS. 200 μl aan kamer dia toevoegen en Incubeer bij RT gedurende 40 min. in het donker. Monteren in 200 μL van vers 1 x PBS of montage media en beeld onmiddellijk (fluorescentie moet worden bewaard tot maximaal 5 dagen, zo niet meer). Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 3 c.Opmerking: Natriumazide kan worden toegevoegd aan de monsters om verontreiniging te voorkomen als confocal imaging niet beschikbaar is. Het toevoegen van een clearing-agent kan verbeteren imaging. 7. geheel-montage van Organoids voor testen en fluorescerende sondes Opmerking: Er zijn verkrijgbare testen en fluorescente sondes/kleurstoffen (voorbeelden zijn opgenomen op de lijst van de materialen) voor gebruik op geheel gemonteerde organoids te observeren van een verscheidenheid van nuttige eindpunten19geamendeerd. Het volgende protocol is voor de fluorescently-gelabelde EdU proliferatie kit, maar elke kit kan worden aangepast voor gebruik met een steekproef geheel gemonteerd. Zorgvuldig verwijderen van 50 μl van media en vervangen door 50 μl van 20 μM 2 x EdU-werkoplossing door pipetteren tegen de zijkant van goed, verlaten ruimte tussen media en matrix gel. Incubeer bij 4 ° C gedurende 1-3 dagen (de gewenste tijdsduur voor EdU inbouw moet worden geoptimaliseerd voor celtype van keuze). Stappen 6.2 – 6.8 overdracht van de organoids van belang op een kamer dia of confocal schotel. PBS verwijderen en monteren met 200 μL van 3,7% paraformaldehyde gedurende 30 minuten op RT terwijl het zachtjes te schudden. Zorgen dat de matrix gel na deze stap duidelijk weergegeven. Verwijder de fixeer en tweemaal met 200 μL van 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden. Verwijder van PBS en voeg 200 μL van 0,5% niet-ionogene wasmiddel-100 in 1 x PBS voor 30 min op RT terwijl het zachtjes te schudden. Bereiden een 1 x TL reactie cocktail volgens specificaties van de fabrikant. Verwijderen van 0,5% niet-ionogene wasmiddel-100 en tweemaal met 200 μL van 3% BSA in 1 x PBS gedurende 5 minuten wassen terwijl het zachtjes te schudden. Voeg reactie cocktail en incubeer gedurende 30 min op RT in het donker. Verwijder de fluorescerende reactie cocktail en wassen met 200 μL van 3% BSA in 1 x PBS voor 5 min terwijl het zachtjes te schudden. Counterstain en mount door na stappen 6.21-6.22 (figuur 3D).