Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschriften, zu bereichern und Substrate der Proteinkinase CK2 aus einer komplexen biologischen Probe z. B. eine Zelle lysate oder Gewebe Homogenat zu identifizieren. Diese Methode nutzt die einzigartigen Aspekte der CK2 Biologie für diesen Zweck.
Abstract
Das Studium der Kinase-Substrat Beziehungen unbedingt ein vollständiges Verständnis der Funktionen von dieser Enzyme und ihre nachgelagerten Ziele in physiologische und pathologische Zustände zu gewinnen. CK2 ist ein evolutionär konservierte Serin/Threonin-Kinase mit einer wachsenden Liste von Hunderten von Substraten in mehreren zellulären Prozessen beteiligt. Aufgrund seiner pleiotropen Eigenschaften ist zu identifizieren und zu charakterisieren ein umfassendes Set an CK2 Substrate besonders anspruchsvoll und bleibt eine Hürde in der Studie dieses wichtigen Enzyms. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir eine vielseitige experimentelle Strategie entwickelt, die es die gezielte Anreicherung und Identifizierung von vermeintlichen CK2 Substrate ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt die einzigartige dual Co Substratspezifität der CK2 zulassend bestimmte Thiophosphorylation der Substrate in einer Zelle oder eines Gewebes lysate. Diese Substrat Proteine werden im Anschluss alkyliert, Immunoprecipitated, und durch flüssige Chromatographie/Tandem Massenspektrometrie (LC-MS/MS) identifiziert. Wir haben früher dieser Ansatz erfolgreich CK2 Substrate von Drosophila Eierstöcken identifizieren und hier verlängern wir die Anwendung dieses Protokolls zu menschlichen Glioblastom-Zellen, illustrieren die Anpassungsfähigkeit dieser Methode zu untersuchen, die biologische Rollen dieser Kinase in verschiedenen Modellorganismen und experimentellen Systemen.
Introduction
Proteinkinasen sind Schlüsselkomponenten der Transduktion Signalkaskaden. Phosphorylierung von Proteinen Substrat durch diese Enzyme entlockt biologische Reaktionen, die kritische Ereignisse, die Kontrolle der Zellteilung, Stoffwechsel und Differenzierung, unter anderem zu regulieren. CK2 ist ein ubiquitär ausgedrückt, acidophilen Serin/Threonin-Kinase, die ist von Hefe für den Menschen erhalten und spielt eine wichtige Rolle in vielen zellulären Prozessen von transcriptional Regelung bis hin zu Zellzyklus Progression zu Apoptose1 ,2,3. Das Enzym ist ein Heterotetramer bestehend aus zwei katalytischen α (oder α’) Untereinheiten und zwei regulatorischen β Untereinheiten4. Abgesehen davon, dass hoch pleiotrope, Exponate CK2 zwei andere ungewöhnlichen Eigenschaften, die ihre Analyse erschweren nämlich konstitutive Aktivität5 und dual Co Substrat Spezifität6. Diese letztere Eigenschaft verleiht CK2 mit der Fähigkeit, GTP sowie ATP für die Phosphorylierung von Proteinen Substrat verwenden.
Genetische Löschung der katalytischen oder regulatorischen Untereinheiten der CK2 bei Mäusen führt zu embryonalen Tödlichkeit darauf hinweist, dass es entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Organogenese7,8 spielt. CK2 ist auch in verschiedenen Arten von Krebs überexprimiert und stellt damit eine vielversprechende therapeutische Ziel9,10,11. In der Tat spezifische Inhibitoren dieses Ziel CK2-Kinase-Aktivität werden derzeit untersucht für diesen Zweck12,13,14. Während Hemmung der CK2 ist ein gangbarer Weg, angesichts seiner pleiotrope Natur, eine Alternative und rationaler Ansatz vielleicht wäre auf kritische CK2 Substrate, die das Fortschreiten bestimmter Krebsarten zugrunde liegen. Daher wäre die umfassende Identifizierung und Charakterisierung von CK2 Substrat Proteine von erheblichem Nutzen für die Aufklärung die spezifische Funktion(en) von dieser Kinase innerhalb eines bestimmten Gewebes oder Tumor-Typs.
Hier beschreiben wir eine vielseitige biochemische Methode zur Identifizierung CK2 Substrate aus einer komplexen biologischen Probe wie einer Zelle oder eines Gewebes lysate. Dieses Protokoll nutzt die dual Co Substratspezifität der CK2 durch Verwendung der GTP-Analogons GTPγS (Guanosin-5′-[γ-thio]triphosphate), die anderen endogenen Kinasen verwenden können. Dadurch können effektiv die Kinase, “seine Substrate innerhalb dieses Beispiel für nachträgliche Isolierung und Identifizierung zu kennzeichnen”.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine relativ einfache biochemische Methode zur Identifizierung Substrate der Proteinkinase CK2 aus einer komplexen biologischen Probe. Die entscheidenden Schritte dieses Protokolls basieren auf die ungewöhnlichen enzymatischen Eigenschaften von CK2 und beinhalten CK2-abhängige Thiophosphorylation von bestimmten Substrat Proteinen mit GTPγS und deren anschließende Immunopräzipitation und Identifikation. Mit diesen Ergebnissen haben wir den nutzen und die Vielseitigkeit dieses Ansatzes ge…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss der Commonwealth Universal Forschung Verbesserung von Pennsylvania Department of Health, T.I.S unterstützt
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
Referencias
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