Mutagénesis sitio-dirigida para In Vitro e In Vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la ARN en Escherichia Coli

ADN se refiere a menudo como el plan de acción de una célula viva ya que todas las estructuras de la célula están codificadas en la secuencia de su ADN. Replicación exacta y mecanismos de reparación del ADN aseguran que se producen sólo muy bajas tasas de mutaciones, que es esencial para mantener la correcta funciones de genes codificados. Los cambios de la secuencia del ADN pueden afectar funciones sucesivas en diferentes niveles a partir de ADN (reconocimiento de factores de transcripción y las enzimas de restricción), entonces RNA (complementariedad de pares de base y alteraciones de la estructura secundaria) o proteínas (aminoácidos ácido sustituciones, supresiones, adiciones o cambios de marco). Mientras que muchas mutaciones no afectan significativamente la función gene, algunas mutaciones en el ADN pueden tener implicaciones enormes. Así, la mutagénesis sitio-dirigida es una valiosa herramienta para el estudio de la importancia de sitios específicos del ADN en todos los niveles.

Este protocolo describe un enfoque de mutagénesis dirigida utilizado para introducir mutaciones específicas. El protocolo se basa en dos estrategias diferentes de la polimerización en cadena: un paso de 2 o un PCR de 3 pasos. La PCR de 2 pasos es aplicable si la mutación deseada está cerca del extremo 5′ o el extremo 3′ del ADN de interés (< 200 pares de bases (bp) desde el extremo) y la PCR de 3 pasos es aplicable en todos los casos.

En el enfoque PCR de 2 pasos, 3 cartillas están diseñados, en la que está diseñado un conjunto de iniciadores para amplificar el ADN de interés (cartillas 1 y 3, adelante y atrás, respectivamente) y una sola cartilla está diseñada para incorporar la mutación. La mutación de la introducción de la cartilla (cartilla 2) debe tener una orientación inversa, si la mutación está cerca del extremo 5′ y una orientación hacia adelante si la mutación es cerca del extremo 3′. En el primer paso de la polimerización en cadena, cartilla 1 + 2 o 2 + 3 amplifica un fragmento pequeño cerca del extremo 5′ o 3′ final, respectivamente. El producto resultante de la polimerización en cadena se utiliza entonces como una cartilla en el paso dos con la cartilla de 1 o 3, lo que resulta en un producto PCR con una mutación en el ADN de interés (figura 1A).

En la PCR 3 pasos, 4 cartillas están diseñados, en la que está diseñado un conjunto de iniciadores para amplificar el ADN de interés (cebadores 1 y 4, adelante y atrás, respectivamente) y un conjunto de iniciadores está diseñado para incorporar mutaciones específicas con la superposición de complementariedad (cartillas 2 y 3, atrás y adelante, respectivamente). En el paso uno y dos, cartillas 1 + 2 y 3 + 4 amplifican el extremo 5′ y 3′. En el paso tres, los productos resultantes de la polimerización en cadena del paso uno y dos se utilizan como plantillas y amplificado con cebadores 1 + 4. Así, el producto resultante de la polimerización en cadena es el ADN de interés con la mutación deseada (figura 1B).

Mientras que el ADN mutado puede usarse para cualquier aplicación posterior, este protocolo describe cómo volver a combinar el ADN en un vector de clonación. El uso de vectores de clonación tiene varias ventajas tales como facilidad de clonación y aplicaciones experimentales específicas dependiendo de características del vector. Esta función se utiliza a menudo para estudios de interacción de la RNA. Otra técnica para estudios de interacción de la RNA es sondear estructural del ARN en complejo con otro RNA^1,2 o proteína^3,4. Sin embargo, sondeo estructural sólo se realiza in vitro mientras que mutagénesis sitio-dirigida y posterior clonación permiten estudios de interacción in vivo.

Mutagénesis dirigida se ha utilizado extensivamente para estudios de interacción de la RNA presentada aquí. Sin embargo, el método clave acerca de 2 – o 3-step PCR es aplicable a cualquier pieza de ADN y así no sólo se limita a los estudios de interacción de la RNA.

Para ejemplificar la técnica y sus posibles usos, se utiliza la caracterización de las regiones importantes para la regulación postranscripcional de la ARNm, csgD, de Escherichia coli (e. coli). En e. coli, csgD es dirigida por el pequeño ARN no codificante, McaS, en cooperación con una proteína Hfq, para reprimir la expresión de la proteína CsgD^2,4,5. La técnica se utiliza para introducir mutaciones en la región de bases entre csgD y McaS y el sitio de unión de Hfq de csgD. El ADN obtenido luego se clona en un vector adecuado para experimentos posteriores. Aplicaciones posteriores de la técnica incluyen experimentos tanto in vivo como in vitro. Para Ilustración, caracteriza en vivo usando un análisis de western blot ejemplo 1 y ejemplo 2 se caracteriza in vitro usando un análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA). En ambos casos, es ilustrada cómo dirigida mutagénesis puede utilizarse en combinación con otras técnicas para establecer conclusiones biológicas sobre un gen de interés.