Сайт Направленный мутагенез для In Vitro и In Vivo экспериментов примером взаимодействия РНК в Escherichia Coli
Summary
Сайт Направленный мутагенез — это метод, используемый для внедрения специфических мутаций в дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Этот протокол описывает, как сделать сайт направленного мутагенеза с шага 2 и 3-х ступенчатая полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе подхода, который применяется к любой фрагмент ДНК интерес.
Abstract
Сайт Направленный мутагенез — это метод, используемый для внедрения конкретных мутации в ДНК для изучения взаимодействия между малых молекул некодирующих рибонуклеиновой кислоты (Срна) и целевой messenger РНК (мРНК). Кроме того сайт Направленный мутагенез используется для сопоставления определенных белков сайтов связывания РНК. Описан шаг 2 и шаг 3 ПЦР на основе внедрения мутаций. Этот подход имеет отношение к всех белков РНК и исследования взаимодействия РНК-РНК. Короче говоря метод полагается на проектирование грунты с желаемой mutation(s) и через 2 или 3 шаги PCR, синтезирующий продукт PCR с мутацией. Затем продукт PCR используется для клонирования. Здесь мы опишем, как выполнять сайт направленного мутагенеза с 2 – х и 3-х ступенчатый подход к внедрению мутации Срна, McaS и мРНК, csgD, расследовать РНК-РНК, РНК белковых взаимодействий. Мы применяем этот метод для изучения взаимодействия РНК; Однако методика применима ко всем исследованиям мутагенез (например, ДНК белковых взаимодействий, амино кислоты замещения/удаления/добавления). Это можно представить какой-либо мутация, за исключением ненатуральных баз, но техника применяется, только если продукт PCR может быть использован для вниз по течению приложения (например, клонирование и шаблон для дальнейшего ПЦР).
Introduction
ДНК часто называют чертеж живой клетки, так как все структуры ячейки кодируются в последовательности ДНК. Точная репликация и ДНК ремонт механизмов гарантируют, что происходят только очень низкие темпы мутаций, которая необходима для поддержания правильной функции закодированных генов. Изменения последовательности ДНК может повлиять на последующие функции на различных уровнях, начиная с ДНК (признание факторов транскрипции и энзимов ограничения), затем РНК (base пара взаимодополняемости и вторичной структуры изменения) и/или белки (аминокислоты кислоты замены, удаления, дополнений или смены кадра). Хотя многие мутации не существенно влияет на функции гена, некоторые мутации в ДНК может иметь огромные последствия. Таким образом сайт Направленный мутагенез является ценным инструментом для изучения важность определенных участков ДНК на всех уровнях.
Этот протокол описывает подход целевой мутагенеза, используется для введения специфических мутаций. Протокол опирается на две разные стратегии ПЦР: шаг 2- или 3-шаг ПЦР. 2-шаг ПЦР является применимым, если желаемый мутации недалеко от ‘ конец 5 или 3’ концу ДНК интерес (< 200 пар оснований (ВР) от конца) и ПЦР 3-шаг применяется во всех случаях.
В 2-х ступенчатый подход ПЦР 3 грунты разрабатываются, в которой один набор праймеров предназначен для того чтобы усилить дна интереса (грунтовки 1 и 3, вперед и назад, соответственно), и один учебник предназначен для включения мутации. Мутация, представляя грунтовка (праймер 2) должен иметь обратный ориентации, если мутации недалеко от ‘ конец 5 и вперед ориентации если мутация близок к 3’ конца. На первом шаге PCR праймер 1 + 2 или 2 + 3 усиливает небольшой фрагмент недалеко от ‘ конец 5 или 3’ конца, соответственно. Полученный продукт PCR затем используется как грунт на втором шаге грунтом 1 или 3, в результате чего в продукт PCR с мутации в ДНК интерес (рис. 1A).
В 3-х ступенчатая PCR 4 грунтовки предназначены, в которых один набор праймеров предназначен для того чтобы усилить дна интереса (грунтовки 1 и 4, вперед и назад, соответственно) и один набор праймеров предназначен для учета специфических мутаций с перекрывающимися взаимодополняемости (грунты, 2 и 3, обратить вспять и вперед, соответственно). В шаге один и два, грунтовки 1 + 2 и 3 + 4 усиливают 5′ и 3′ конца. На шаге 3 результирующий продукты PCR от шаг 1 и 2 используются как шаблоны и усиливается с праймерами 1 + 4. Таким образом полученный продукт PCR является ДНК интерес с желаемой мутация (рис. 1B).
В то время как мутировал ДНК может использоваться для любого приложения, ниже по течению, этот протокол описывает вновь объединить вектор клонирования ДНК. Использование клонирования векторов имеет ряд преимуществ, таких как простота клонирования и конкретных экспериментальных приложений в зависимости от особенностей вектора. Эта возможность часто используется для исследования взаимодействия РНК. Другой метод для исследования взаимодействия РНК является структурной зондирующего РНК в комплексе с другой РНК1,белка или2 3,4. Однако структурные зондирование выполняется только в пробирке в то время как сайт направленного мутагенеза и последующего клонирования позволяют для исследования взаимодействия в естественных условиях.
Сайт Направленный мутагенез широко применяется для исследования взаимодействия РНК, представленные здесь. Однако ключевым методом относительно 2 – или 3-шаг ПЦР применима к любой фрагмент ДНК и таким образом не ограничивается только исследования РНК взаимодействия.
Чтобы проиллюстрировать, техника и его возможного использования, используется характеристика регионов важно для post-transcriptional регулирование мРНК, csgD, Escherichia coli (E. coli). В E. coli, csgD является мишенью малые РНК-кодирования, McaS, в сотрудничестве с белками, Hfq, для подавления выражения протеина CsgD2,4,5. Метод используется для внедрения мутаций в регионе база сопряжения между csgD и McaS и Hfq привязки сайта csgD. Затем полученные ДНК клонируется в вектор подходит для последующих экспериментов. Нисходящие приложения методики включают в vivo и in vitro экспериментов. Для иллюстрации пример 1 характеризуется в естественных условиях, используя западную помарку пробирного и пример 2 характеризуется в пробирке, используя assay переноса электрофоретической подвижности (EMSA). В обоих случаях это иллюстрированный как сайт Направленный мутагенез может использоваться в сочетании с другими методами биологического выводы о ген интереса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сайт Направленный мутагенез имеет широкий спектр различных приложений, и здесь, представитель результаты от in vivo и эксперимент в лабораторных условиях были включены в качестве примеров того, как сделать биологических выводы, используя технику. Сайт Направленный мутагенез уже давно зо…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Университет Южной Дании открытого доступа политики грантов.
Materials
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
Referencias
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5′ mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
