Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

DNA é muitas vezes referida como a estrutura de uma célula viva, uma vez que todas as estruturas da célula são codificadas na sequência de seu DNA. Replicação exata e mecanismos de reparo do DNA certifique-se de que só muito baixas taxas de mutações ocorrem, que é essencial para sustentar as funções corretas dos genes codificados. Alterações da sequência de DNA podem afetar funções sucessivas em diferentes níveis, começando com o DNA (reconhecimento por enzimas de restrição e fatores de transcrição), em seguida RNA (alterações de estrutura secundária e complementaridade de pares de base) e/ou proteínas (amino ácido substituições, supressões, adições ou quadro-turnos). Enquanto muitas mutações não afetam significativamente a função do gene, algumas mutações no DNA podem ter implicações enormes. Assim, o mutagenesis local-dirigido é uma ferramenta valiosa para estudar a importância dos locais específicos do DNA em todos os níveis.

Este protocolo descreve uma abordagem de mutagénese alvo usada para introduzir mutações específicas. O protocolo se baseia em duas diferentes estratégias PCR: um 2-passo ou um passo 3-PCR. Passo 2 PCR é aplicável se a mutação desejada está perto da extremidade 5′ ou extremidade 3′ do DNA de interesse (< 200 pares de bases (bp) da extremidade) e o PCR do passo 3-é aplicável em todos os casos.

Na abordagem PCR no passo 2, 3 primeiras demão são projetadas, na qual destina-se um conjunto de primers para amplificar o DNA de interesse (primeiras demão 1 e 3, para a frente e reverso, respectivamente), e um único primer é projetado para incorporar a mutação. A mutação, apresentando a primeira demão (cartilha 2) deve ter uma orientação reversa, se a mutação é perto da extremidade 5′ e uma orientação para a frente se a mutação está perto da extremidade 3′. Na primeira etapa do PCR, cartilha 1 + 2 ou 2 + 3 amplifica um fragmento pequeno perto da extremidade 5′ ou 3′ final, respectivamente. O produto resultante da PCR é usado como um primer na etapa dois com primer 1 ou 3, resultando em um produto PCR com uma mutação no DNA de interesse (figura 1A).

No passo 3-PCR, 4 cartilhas destinam-se, na qual destina-se um conjunto de primers para amplificar o DNA de interesse (primeiras demão 1 e 4, para a frente e reverso, respectivamente) e um conjunto de primers é projetado para incorporar mutações específicas com sobreposição de complementaridade (primers, 2 e 3, reverter e encaminhar, respectivamente). Na etapa 1 e 2, as primeiras demão 1 + 2 e 3 + 4 amplificam a extremidade 5′ e 3′. No terceiro passo, os produtos resultantes da PCR de passo um e dois são usados como modelos e amplificado com iniciadores 1 + 4. Assim, o produto resultante da PCR é o DNA de interesse com a mutação desejada (figura 1B).

Enquanto o DNA modificado pode ser usado para qualquer aplicação a jusante, este protocolo descreve como re-combinar o DNA em um vetor de clonagem. A utilização de vectores de clonagem tem diversas vantagens tais como facilidade de clonagem e aplicações experimentais específicas dependendo de características do vetor. Esse recurso é usado frequentemente para estudos de interacção de RNA. Outra técnica para estudos de interação RNA está sondando estruturais do RNA em complexo com outro RNA^1,2 ou proteína^3,4. No entanto, sondagem estrutural só é executada em vitro considerando mutagenesis local-dirigido e clonagem subsequentes permitem estudos de interação in vivo.

Mutagenesis local-dirigido tem sido extensivamente usado para estudos de interação RNA como apresentado aqui. No entanto, o método chave sobre 2 ou 3-passos PCR é aplicável a qualquer pedaço de DNA e, portanto, não apenas limitada a estudos de interação com o RNA.

Para exemplificar a técnica e seus possíveis usos, caracterização de regiões importantes para regulação pós-transcricional do mRNA, csgD, de Escherichia coli (e. coli) é usada. Em e. coli, csgD destina-se a pequeno RNA não-codificante, McaS, em cooperação com uma proteína, Hfq, para reprimir a expressão da proteína de CsgD^2,4,5. A técnica é usada para introduzir mutações para a região de base-emparelhamento entre csgD e McaS e o sítio de ligação do Hfq de csgD. O DNA obtido é então clonado em um vetor apropriado para experimentos subsequentes. Aplicações a jusante da técnica incluem experimentos in vivo e in vitro. Para ilustração, exemplo 1 é caracterizado em in vivo usando um ensaio de borrão ocidental e exemplo 2 caracteriza-se in vitro usando um ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA). Em ambos os casos, é ilustrado o mutagenesis local-dirigido como pode ser usado em combinação com outras técnicas para fazer conclusões biológicas sobre um gene de interesse.