Nettstedet-rettet mutagenese for In Vitro og Vivo eksperimenter eksemplifisert med RNA samhandling i Escherichia Coli

DNA er ofte referert til som blåkopi av en levende celle siden alle strukturer av cellen er kodet i sekvensen av sin DNA. Nøyaktig replikering og DNA reparasjon mekanismer sikrer at bare svært lave priser av mutasjoner oppstår, som er avgjørende for å opprettholde riktige funksjonene av kodet gener. Endringer av DNA sekvensen kan påvirke påfølgende funksjoner på ulike nivåer starter med DNA (anerkjennelse av transkripsjonsfaktorer og begrensning enzymer), deretter RNA (base-par komplementaritet og sekundær endringer) og/eller protein (aminosyre Acid erstatninger, sletting, tilleggene eller ramme-Skift). Mens mange mutasjoner ikke påvirker gen funksjon betydelig, kan noen mutasjoner i DNA har enorme implikasjoner. Dermed er området-rettet mutagenese et verdifullt verktøy for å studere betydningen av spesifikke DNA nettsteder på alle nivåer.

Denne protokollen beskriver en målrettet mutagenese tilnærming brukes til å introdusere spesifikke mutasjoner. Protokollen er avhengig av to forskjellige PCR strategier: en 2-trinns eller en 3-trinns PCR. 2-trinns PCR gjelder hvis ønsket mutasjon ligger 5′ slutten eller 3 slutten av DNA av interesse (< 200 base parene (bp) fra slutten) og 3-trinns PCR gjelder i alle tilfeller.

I 2-step PCR tilnærming, 3 primere er utformet som en rekke primere er utviklet for å forsterke DNA av interesse (primere 1 og 3, fremover og bakover, henholdsvis) og en enkelt primer er utformet for å innlemme mutasjon. Mutasjon introdusere grunning (primer 2) bør ha en omvendt retning hvis mutasjon er 5′ slutten og en forover retning hvis mutasjon ligger 3 slutten. I det første trinnet PCR forsterker primer 1 + 2 eller 2 + 3 et lite fragment nær 5′ slutten eller 3 slutt, henholdsvis. PCR sluttproduktet brukes deretter som en primer i trinn to med primer 1 eller 3, dermed resulterer i et PCR-produkt med en mutasjon i DNA av interesse (figur 1A).

Den 3-trinns PCR, 4 primere er utformet, der ett sett med primere er utviklet for å forsterke DNA av interesse (primere 1 og 4 fremover og bakover, henholdsvis) og en rekke primere er utformet for å omfatte spesifikke mutasjoner med overlappende komplementaritet (primere 2 og 3, snu og videresende, henholdsvis). I trinn en og to, primere 1 + 2 og 3 + 4 forsterke 5′ og 3 slutten. I trinn tre, de resulterende PCR produktene fra trinn en og to er stjernen og forsterket med primere 1 + 4. Dermed er PCR sluttproduktet DNA av interesse med ønsket mutasjon (figur 1B).

Mens mutert DNA kan brukes for alle nedstrøms søknad, beskriver denne protokollen hvordan å kombinere DNA i en kloning vektor. Bruk av kloning vektorer har flere fordeler som brukervennlighet kloning og bestemte eksperimentelle programmer avhengig av funksjoner av vektoren. Denne funksjonen brukes ofte for RNA samhandling studier. En annen teknikk for RNA samhandling studier er strukturelle undersøkelser av RNA i kompleks med en annen RNA^1,2 eller protein^3,4. Imidlertid utføres strukturelle undersøkelser bare i vitro mens området-rettet mutagenese og påfølgende kloning tillater samhandling studier i vivo.

Nettstedet-rettet mutagenese har vært mye brukt for RNA samhandling studier som presenteres her. Men den viktigste metoden om 2 eller 3-trinn PCR gjelder for ethvert stykke DNA, og dermed ikke bare begrenset til RNA-interaksjon studier.

Du eksemplifiserer teknikken og bruksområdene, brukes karakteristikk av regioner viktig for post-transcriptional regulering av mRNA, csgD, av Escherichia coli (E. coli). E. coli , csgD er rettet av små ikke-koding RNA, McaS, i samarbeid med en protein, Hfq, å undertrykke protein uttrykk CsgD^2,4,5. Teknikken brukes til å introdusere mutasjoner base-sammenkobling området mellom csgD og McaS og Hfq binding området av csgD. Innhentet DNA er deretter klonet i en vektor egnet for senere eksperimenter. Nedstrøms programmer av teknikken omfatter både i vivo og in vitro eksperimenter. For illustrasjon, eksempel 1 er preget i vivo bruker en western blot analysen og eksempel 2 er preget i vitro bruker en electrophoretic mobilitet Skift analyse (EMSA). I begge tilfeller er det illustrert hvordan området-rettet mutagenese kan brukes i kombinasjon med andre teknikker for å gjøre biologiske konklusjoner om en genet av interesse.