사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서
Summary
사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.
Abstract
사이트 지시 된 mutagenesis은 작은 비 코딩 ribonucleic 산 (요 스르나.) 분자와 대상 메신저 RNAs (mRNAs) 간의 상호 작용을 조사 하기 위하여 DNA에 있는 특정 돌연변이 소개 하는 기술입니다. 또한, 사이트 지시 된 mutagenesis는 RNA를 특정 단백질 바인딩 사이트를 매핑하는 데 사용 됩니다. 돌연변이의 2 단계와 3 단계 PCR 기반 소개 설명 되어 있습니다. 접근은 모든 단백질-RNA와 RNA RNA 상호 작용 연구에 관련이 있다. 즉, 기술 설계 뇌관 원하는 mutation(s)와 돌연변이 PCR 제품을 합성 하는 PCR의 2 또는 3 단계를 통해 사용 합니다. PCR 제품은 복제에 사용 됩니다. 여기, 우리는 요 스르나., McaS, 그리고 mRNA, csgD, RNA RNA와 RNA-단백질 상호 작용을 조사 하는 돌연변이 소개 하는 두 2 및 3 단계 접근 방식으로 mutagenesis 사이트 감독을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 우리 조사 RNA 상호 작용;이 기법을 적용 그러나, 기술은 모든 mutagenesis 연구 (예를 들어, DNA 단백질 상호 작용, 아미노 산 대체/삭제/추가)에 적용 됩니다. 비 자연 기지를 제외 하 고 돌연변이의 어떤 종류를 소개 수 있지만 기술은만 경우 적용 PCR 제품 다운스트림 응용 프로그램 (예: 복제 추가 PCR에 대 한 서식 파일)에 사용할 수 있습니다.
Introduction
DNA는 종종 라고 합니다 살아있는 세포의 청사진 때문에 모든 구조는 세포의 DNA의 순서에 인코딩됩니다. 정확한 복제 및 DNA 수리 메커니즘 코딩된 유전자의 정확한 기능 유지에 필수적입니다, 돌연변이의 매우 낮은 요금 발생 확인 합니다. DNA 순서의 변화 다음 (자료 쌍 complementarity 그리고 이차 구조 변경) RNA 및 단백질 (아미노산 DNA 전사 요소와 제한 효소 (인식)로 시작 하는 서로 다른 수준에서 연속 함수에 영향을 미칠 수 있습니다. 산 성 대체, 삭제, 추가 또는 프레임 교대). 많은 돌연변이 유전자 기능을 크게 미치지 않습니다, 그러나 일부 돌연변이 DNA에서 거 대 한 의미를 가질 수 있습니다. 따라서, 사이트 지시 된 mutagenesis 모든 수준에서 특정 DNA 사이트의 중요성을 공부 하기 위한 유용한 도구입니다.
이 프로토콜에는 특정 돌연변이 소개 하는 데 사용 하는 타겟된 mutagenesis 접근 방식을 설명 합니다. 두 개의 서로 다른 PCR 전략에 의존 하는 프로토콜: 2 단계 또는 3 단계 PCR. 2 단계 PCR는 적용 가능한 경우 원하는 돌연변이의 DNA의 3′ 끝 또는 5′ 끝은 (< 200 기본적인 쌍 (bp) 끝에서) 3 단계 PCR 모든 경우에 적용 됩니다.
2 단계 PCR 방법에서 3 프라이 머는, 있는 뇌관의 한 세트의 (뇌관 1, 3, 앞으로 및 역방향, 각각), DNA를 증폭 하도록 설계 되었습니다 및 단일 뇌관은 돌연변이 통합 하도록 설계 되었습니다. 뇌관 (뇌관 2)을 소개 하는 돌연변이 돌연변이 5′ 끝과 앞으로 방향 경우 경우 돌연변이 3′ 끝은 역 방향이 있어야 합니다. 첫 번째 PCR 단계에서 뇌관 1 + 2 또는 2 + 3 각각 5′ 끝 또는 3′ 끝, 가까이 작은 파편을 증폭 한다. 유래 PCR 제품은 뇌관 1 또는 3, 관심 (그림 1A)의 DNA에 돌연변이와 PCR 제품에 따라서 결과와 2 단계에서 뇌관으로 사용 됩니다.
3 단계 PCR에 있는 뇌관의 1 세트는 (뇌관 1, 4, 앞으로 및 역방향, 각각)의 DNA를 증폭 하도록 설계 되었습니다. 4 뇌관 설계는 뇌관의 1 세트는 겹치는 complementarity 특정 돌연변이 통합 하도록 설계 되었습니다. (2, 3, 뇌관 역 그리고 앞으로, 각각). 1 및 2 단계에서 뇌관 1 + 2 및 3 + 4 증폭 5’과 3′ 끝. 3 단계에서 로부터 유래 PCR 제품 1 단계 고 2는 사용 뇌관 1 + 4와 증폭. 따라서, 결과 PCR 제품은 원하는 돌연변이 (그림 1B)에 대 한 관심의 DNA 이다.
돌연변이 DNA 모든 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다,이 프로토콜에 다시 클로닝 벡터에는 DNA를 결합 하는 방법을 설명 합니다. 클로닝 벡터의 사용 복제의 용이성 등 몇 가지 장점이 및 벡터의 기능에 따라 특정 실험적인 응용 프로그램. 이 기능은 RNA 상호 작용 연구를 위해 자주 사용 됩니다. RNA 상호 작용 연구에 대 한 또 다른 기술은 다른 RNA1,2 또는 단백질3,4단지에서 RNA의 구조 조사입니다. 그러나, 구조 조사만 수행 됩니다 생체 외에서 반면 사이트 지시 된 mutagenesis와 후속 복제 허용 상호 작용 연구에 대 한 vivo에서.
사이트 지시 된 mutagenesis는 광범위 하 게 사용 되었습니다 RNA 상호 작용 연구로 여기에 제시. 그러나, 주요 방법에 관한 2-또는 3-단계 PCR는 DNA의 어떤 조각에 적용 이며 따라서 RNA 상호 작용 연구에 제한 뿐만 아니라.
기술과 그것의 가능한 사용을 예증 하 지역에 mRNA, 대장균 (대장균)의 csgD 의 post-transcriptional 규제에 대 한 중요 한 특성은 사용 됩니다. 대장균, csgD에서 대상 이다 작은 비 코딩 RNA, McaS, 단백질, Hfq, CsgD2,,45의 단백질 발현을 억 누르기 위해 협력. 기술은은 돌연변이 csgD , McaS, 사이 베이스 페어링 지역 그리고 csgD의 Hfq 바인딩 사이트에 소개 하는 데 사용 됩니다. 얻은 DNA는 다음 후속 실험에 적합 한 벡터에 복제 됩니다. 기술은의 다운스트림 응용 프로그램에는 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험 포함 됩니다. 이해를 돕기 위해 예제 1은 생체 조건 서쪽 오 점 분석 결과 사용 하 여 특징 하 고 예제 2 생체 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)를 사용 하 여 특징입니다. 두 경우 모두, 그것은 그림된 어떻게 사이트 감독 mutagenesis 관심의 유전자에 대 한 생물 학적 결론을 다른 기술 함께에서 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
사이트 지시 된 mutagenesis는 광범위 한 다른 응용 프로그램, 그리고 여기, 대표는 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험 결과 기술을 사용 하 여 생물학적 결론을 확인 하는 방법의 예제로 포함 했다. 사이트 지시 된 mutagenesis는 오랫동안 RNA 상호 작용 연구에 대 한 황금 표준 되었습니다. 기술의 강점 다운스트림 분석 실험 및 실험 (예를들면, 서쪽 오 점 또는 EMSA)에 유전자 제품의 기능에 특정 DNA 사이트 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 남쪽 덴마크의 대학 오픈 액세스 정책 보조금을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
Referencias
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