サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験
Summary
サイト指示された突然変異誘発は、デオキシリボ核酸 (DNA) の特定の突然変異を導入する技術です。このプロトコルは、2 ステップでサイト指示された突然変異誘発を行う方法をについて説明し、3 ステップのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) ベースのアプローチは、興味の DNA のフラグメントに適用可能であります。
Abstract
サイト指示された突然変異誘発は小さな非コーディング リボ核酸 (スルナ) 分子と対象のメッセンジャー Rna (Mrna) の相互作用を調査するため DNA の特定の突然変異を導入するための技術です。さらに、サイト指示された突然変異誘発は RNA 特定の蛋白質の結合サイトにマップされます。突然変異の 2 ステップ、3 ステップ PCR によって基づく概要を説明しています。アプローチはすべての蛋白質と核酸と RNA 相互作用の研究に関連します。一言で言えば、テクニックが必要な遺伝と突然変異を PCR の製品を合成 PCR の 2 または 3 の手順をプライマーの設計に依存します。PCR の製品は、クローニングのため使用されます。ここでは、両方の 2 と 3 のステップ アプローチ、スルナ、岩国、mRNA、 csgD RNA、RNA 蛋白質の相互作用を調査するために突然変異を導入するとサイト指示された突然変異誘発を実行する方法をについて説明します。RNA の相互を調査するこの手法を適用します。しかし、技術は、すべての突然変異誘発の研究 (DNA 蛋白質の相互作用、アミノ酸置換/削除/追加など) に適用されます。非天然基地を除いて突然変異のあらゆる種類を導入することが可能だが、テクニックは下流のアプリケーション (例えば、クローニングとさらに PCR のテンプレート) の PCR の製品を使用できる場合のみ。
Introduction
DNA は、セルのすべての構造は、DNA のシーケンスにエンコードから、一般に、生きている細胞の設計図と呼ばれます。正確なレプリケーションおよび DNA 修復機構は、唯一の非常に低率の突然変異が発生し、コード化された遺伝子の正しい機能を維持するために不可欠であるを確認します。DNA シーケンスの変更は、RNA (塩基対の相補性と二次構造変化) やタンパク質 (アミノ酸、DNA (転写因子と制限酵素によって認識)、始まるさまざまなレベルで連続的な機能に影響を及ぼす酸の置換、削除、追加またはフレーム シフト)。多くの突然変異は遺伝子の機能を大きく影響しません、DNA の変異の巨大な影響があります。したがって、サイト指示された突然変異誘発は、すべてのレベルで特定の DNA のサイトの重要性を研究するための貴重なツールです。
このプロトコルでは、特定の突然変異を導入するために使用対象となる突然変異誘発方法について説明します。プロトコルは、2 つの PCR 戦略: 2 ステップ、3 ステップ PCR。2 ステップ PCR は望ましい突然変異が 5′ 端または興味の DNA の 3′ 末端に近い場合は該当する (< 端から 200 塩基対 (bp)) と 3 ステップ PCR はすべての場合に適用されます。
2 ステップ PCR のアプローチで 3 プライマーを (プライマー 1 と 3、前方および逆引き、それぞれ)、興味の DNA を増幅するプライマーの 1 つのセットを設計、単一のプライマーは突然変異を組み込む設計されています。3′ 端に近い場合は突然変異変異を 5′ 末端と前方方向に近い場合 (プライマー 2) プライマーの導入変異が逆向きに必要です。最初の PCR のステップでは、プライマー 1 + 2 または 2 + 3 はそれぞれ 5′ 末端もしくは 3′ 末端、近くの小さな断片を増幅します。結果として得られる PCR の製品はプライマー 1 または 3、(図 1 a) の興味の DNA の変異を PCR の製品の結果を 2 つの手順でプライマーとして使用されます。
3 ステップ PCR のプライマーの 1 つのセットは (プライマー 1 と 4 は、前方および逆引き、それぞれ) 興味の DNA を増幅するため設計されています 4 プライマーが設計されています、相補性を重複で特定の突然変異を組み込むように、プライマーの 1 つのセット(プライマー 2 と 3 は逆し、転送、それぞれ)。手順 1 と 2、1 + 2、3 + 4 のプライマーが 5′ と 3′ 端を増幅します。ステップ 3 で結果として得られる PCR の製品からステップ 1 と 2 つのテンプレートとして使用し 1 + 4 のプライマーで増幅します。したがって、結果として得られる PCR の製品は望ましい突然変異 (図 1 b) と興味の DNA です。
変異する DNA は、任意のダウン ストリーム アプリケーションの使用できますが、このプロトコルはクローニング ベクトルに DNA を再結合する方法について説明します。クローニングの使用クローン作成の容易さなどいくつかの利点がありますとベクターの機能に応じて実験用途。この機能は RNA 相互作用研究のためよく使用されます。RNA 相互作用研究のための別のテクニックは別 RNA1,2または蛋白質3,の4との複合体の RNA の構造を探るします。ただし、構造プローブのみ実行される体外サイト指示された突然変異誘発と後続のクローニングが生体内での相互作用研究の許可。
サイト指示された突然変異誘発は、ここで示す RNA 相互作用研究のため広く使用されています。ただし、キーメソッドについて 2- または 3 ステップ PCR は DNA のどの部分に適用され、従って RNA 相互作用の研究だけでなく限られました。
技術とその用途を例示、 csgD、 エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) の mRNA の転写後調節に重要な領域の評価を使用します。エシェリヒア属大腸菌、csgDで狙われてる小さな非コーディングの RNA、岩国、Hfq、CsgD2,4、5の発現を抑制する蛋白質と協力。技術を使用して、 csgDと、岩国基地ペアリング地域とcsgDの Hfq 結合部位に変異を導入します。得られた DNA は、その後の実験に適したベクターにクローンを作成します。技術の下流のアプリケーションには、生体内および生体外での実験が含まれます。図では、例 1 の西部のしみのアッセイを用いた生体内の特徴は、例 2 は電気泳動の移動性シフト試金 (EMSA) を使用して生体外の特徴です。両方のケースでそれは図解方法サイト指示された突然変異誘発は興味の遺伝子の生物学的結論を出すために他の技術との組み合わせで使用できますです。
Protocol
Representative Results
Discussion
サイト指示された突然変異誘発、さまざまなアプリケーションの広範な配列がありここでは、典型的な結果を in vivo と in vitro の実験からの手法を用いて生物学的結論の作り方の例として含まれていた。サイト指示された突然変異誘発は長い RNA 相互作用研究の黄金の標準をされています。技術の強みは下流の試金との遺伝子産物の機能の DNA の特定のサイトとその重要性についての結論を描?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、南デンマーク大学オープン アクセス ポリシー付与を感謝したいです。
Materials
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
Referencias
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5′ mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
