Summary

Kwantitatieve onderzoek van antibiotische gevoeligheid van Neisseria gonorrhoeae met behulp van aggregaten ATP-gebruik commerciële testen en Live/Dead vlekken

Published: February 08, 2019
doi:

Summary

Een eenvoudige ATP-metende assay en leven/dood kleuring methode dienden te kwantificeren en te visualiseren van Neisseria gonorrhoeae voortbestaan na de behandeling met ceftriaxone. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de antimicrobiële gevolgen van een antibioticum en kan worden gebruikt voor het definiëren van de minimale remmende concentratie van antibiotica in bacteriële biofilms.

Abstract

De opkomst van antibiotica resistente Neisseria gonorrhoeae (GC) is een wereldwijd gezondheidsbedreiging en wijst op de noodzaak om te identificeren van individuen die niet van de behandeling. Deze gram-negatieve bacterie veroorzaakt gonorroe uitsluitend bij mensen. Tijdens de infectie is het kundig voor formulier aggregaten en/of biofilms. De minimale remmende concentratie (MIC) test wordt gebruikt om te bepalen van de gevoeligheid voor antibiotica en definiëren passende behandeling. Het mechanisme van de uitroeiing in vivo en haar relatie tot laboratoriumresultaten zijn echter niet bekend. Een methode die bespreekt hoe de GC aggregatie beïnvloedt antibiotische gevoeligheid en toont de relatie tussen de totale omvang en antibiotische gevoeligheid werd ontwikkeld. Wanneer GC aggregaat, ze meer resistent tegen antibiotica doden zijn, surviving met de bacteriën in het midden ceftriaxone behandeling beter dan die in de periferie. De gegevens wijzen erop dat N. gonorrhoeae aggregatie zijn gevoeligheid voor ceftriaxone, die niet wordt weerspiegeld met behulp van de standaard agar plaat gebaseerde MIC methoden kan verminderen. De methode die wordt gebruikt in deze studie zal de onderzoekers voor het testen van bacteriële gevoeligheid onder klinisch relevante voorwaarden toestaan.

Introduction

Gonorroe is dat een seksueel overdraagbare infecties (SOA)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), een gram-negatieve bacterie diplococcal, is de verwekker van de ziekte. Symptomen van genitale infectie kunnen leiden tot pijn tijdens het plassen, gegeneraliseerde genitale pijn en urethrale kwijting. -Infectie is vaak asymptomatisch2,3,4,5, en dit zorgt voor uitgebreide kolonisatie. Deze onbehandelde infecties zijn een belangrijke gezondheids-zorg, zoals ze het potentieel hebben om de transmissie van het organisme en dit kan leiden tot complicaties, zoals pelvic inflammatory disease (PID) en verspreid gonococcal infectie (DGI)6. Antibiotica-resistente gonorroe is een belangrijke volksgezondheid crisis en een toenemende sociaal-economische last7. Verminderde gevoeligheid voor cefalosporines heeft geresulteerd in behandeling regime verandering van een enkel antibioticum naar dual therapie, die azithromycine of doxycycline met ceftriaxone8 combineert. De grotere mislukking van ceftriaxone en azithromycine9,10, in combinatie met asymptomatische infecties, benadrukt de noodzaak voor het begrijpen van gonorroe behandeling mislukkingen.

De minimale remmende concentratie (MIC) test, met inbegrip van agar verdunning en disc diffusie proeven, is gebruikt als de standaard medische test voor het identificeren van de weerstand tegen een antibioticum. Het is echter onduidelijk of de MIC test bacteriële resistentie tegen antibiotica in vivo weerspiegelt. De vorming van bacteriële biofilms draagt bij tot het voortbestaan van de bacteriën in aanwezigheid van de bactericide concentraties van antibiotica: het testen van de MIC is niet in staat om te ontdekken dit effect11. Omdat GC biofilms op mucosal oppervlakken12 vormen kan, we veronderstellen dat antibiotica gevoeligheid binnen aggregaten zou verschillen van die in afzonderlijke GC gezien. Bovendien, hebben studies aangetoond dat drie variabele oppervlakte moleculen, Pili, dekking-geassocieerde proteïne (Opa fasen), en lipooligosaccharides (LOS), die tussen bacterie interacties regelen, tot verschillende formaat aggregaten13, leiden 14 , 15. de bijdrage van deze componenten tot resistentie tegen antibiotica is niet onderzocht vanwege het ontbreken van goede methoden.

Momenteel zijn er verschillende methoden voor het meten van biofilm uitroeiing. De meest gebruikte kwantitatieve methode is door het meten van de veranderingen in de biomassa met behulp van crystal violet kleuring van16. De methode vereist echter aanzienlijke experimentele manipulatie, die mogelijk fouten in experiment herhaald17 genereren kunt. De live/dead kleuringstechniek gebruikt hier kunt visualisatie van levende en dode bacteriën en hun verdeling binnen de biofilm. Echter kan de structuur van de biofilm opleveren als een fysieke barrière die kleurstofpenetratie vermindert. Daarom, om te kwantificeren live/dode bacteriën binnen een groep, de kleuring is beperkt tot kleine biofilms of zijn voorloper-microcolonies of samenvoegingen. Andere methoden, met inbegrip van de agar verdunning en schijf diffusie proeven, kunnen niet voor het meten van de effecten van aggregatie. Te onderzoeken GC gevoeligheid binnen aggregatie na antibiotica blootstelling, een ideale methode zou moeten hebben zowel een kwantitatieve bepaling dat kan meten bacteriën leven en visualiseren van hun distributie.

De hier beschreven procedure combineert een ATP-benutting-meting en een leven/dood kleuring assay aan kwantitatief en visueel onderzoekt de GC gevoeligheid binnen aggregaten in aanwezigheid van antibiotica.

Protocol

1. algemeen onderhoud van GC stammen Strijk N. gonorrhoeae -stammen op GCK agar met 1% Kellogg18 (tabel 1, tabel 2) uit de vriezer voorraden aanvult en incubeer 37 ° C met 5% CO2 voor 16-18 h. gebruik MS11 uiting van fase-variabele Opa (MS11Opa +), geen Opa (MS11ΔOpa), of een afgekapte LOS (MS11ΔLgtE). Kies zorgvuldig pili negatieve (kolonie zonder donkere rand) of positieve (kolonie met donkere rand) kolonies van elke stam op basis van d…

Representative Results

Twee methoden werden gebruikt: een ATP gebruik assay en een kwantitatieve analyse voor de kleuring van leven/dood. De resultaten kunnen worden gecombineerd of afzonderlijk gebruikt voor de behandeling van bacteriële voortbestaan binnen aggregaten na behandeling met antibiotica. De ATP gebruik assay gebleken voor het meten van nauwkeurig levensvatbare bacteriën in S. aureus biofilms20,21. Hier, werd MS11Opa + Pil + spann…

Discussion

Bacteriën kunnen vormen biofilms tijdens infectie van het menselijk lichaam. Traditionele MIC testen kan niet overeen met de concentratie die nodig zijn voor de uitroeiing van bacteriën in een biofilm. Om te testen antimicrobiële stoffen effecten op een biofilm, kunnen de methoden op basis van biofilm biomassa evenals plating CFUs verkeerde als gevolg van de impact van biofilm structuur. Bijvoorbeeld, werkt de plating-methode alleen als de biofilm kan worden verstoord. Vandaar, de CFU verkregen kan lager zijn dan het …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door een subsidie van de National Institute of Health W.S. AI123340 te D.C.S.. L.-C.W., J.W., AC, en E.N. werden ondersteund in het onderdeel/deelname aan “The eerstejaars innovatie & onderzoek Experience”-programma gefinancierd door de Universiteit van Maryland. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking van, of de bereiding van het manuscript. Wij erkennen de UMD CBMG Imaging Core voor alle microscopie experimenten.

Materials

100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

Referencias

  1. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  2. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  3. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  4. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
  5. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  6. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  7. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  8. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  9. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
  10. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  11. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  12. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  13. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
  14. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  15. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
  16. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  17. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  18. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  19. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
  20. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  21. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  22. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  23. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  24. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  25. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

Play Video

Citar este artículo
Wang, L., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

View Video