Bu protokol, bir hücre sıralama temel yöntem, floresan gabaergic veya glutamaterjik nöronların neokorteks ve Hippocampus gelen postnatal fareler veya farelerin arıtma ve kültürü için açıklar.
Bu protokolün genel amacı, GABAergic veya glutamaterjik nöronlardan elde edilen saflaştırılmış nöronal kültürler oluşturmaktir. Saflaştırılmış nöronlar 16 gün içinde vitro için tanımlanmış medyada kültürlü olabilir ve tipik olarak ayrık kültürler üzerinde gerçekleştirilen herhangi bir analizler için imkan vardır, elektrofizyolojik dahil, morfolojik ve hayatta kalma analizleri. Bu kültürlerin en önemli avantajı, belirli hücre türlerinin, glial hücrelerden veya diğer nöron türlerinden kaynaklanan gibi karmaşık dış etkilerinin yokluğunda seçmeli olarak incelenebilir olmasıdır. Ancak, arıtılmış hücrelerle deneyler planlarken, nöronlar güçlü onların büyüme ve hayatta kalmak için glia-Klima medya bağlıdır dikkat etmek önemlidir. Buna ek olarak, glutamaterjik nöronlar daha da sinaptik iletim kurulması için glia-salgılanmış faktörlere bağlıdır. Bu nedenle aynı zamanda bir temas olmayan düzenleme nöronlar ve glial hücreler Co-kültürleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemleri kullanarak, biz gabaergic ve glutamaterjik nöronal ağlar gelişimi arasında büyük farklar tespit ettik. Böylece, saflaştırılmış nöronların kültürlerinin incelenmesi sinir sisteminin nasıl geliştiğini ve işlevlerini anlamımızı sürdürmek için büyük bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, arıtılmış kültürler farmakolojik ajanların doğrudan eylemini, büyüme faktörlerini veya belirli hücre türlerinde genetik manipülasyonların sonuçlarını araştırmak için yararlı olabilir. Daha fazla ve daha fazla transgenik hayvanlar kullanılabilir hale, ilgi ek belirli hücre türleri etiketleme, biz protokoller burada açıklanan kendi Uygulanabilirlik ve potansiyel büyüyecektir bekliyoruz.
Hücre sıralama hücrelerin heterojen bir karışımı ilgi yaşam hücrelerinin yalıtım için güçlü bir araçtır. Hücreler boyut ve şekil ölçütlerine bağlı olarak, floresan işaretleyicilerinin1,2ifadesinin yanı sıra sıralanabilir. Genellikle, fluorophore-konjuke antikorlar hücre özgü yüzey antijenleri3,4hedefleme tarafından farklı hücre türlerini etiketlemek için kullanılır. Alternatif olarak, transgenik hayvanlar veya viral teslimat sistemleri, hücre spesifik promotörler5,6altında fluorophores ifade etmek için tasarlandı. Tarihsel olarak, transgenik araçların ve hayvanların gelişimi maliyetli ve zaman alıcı oldu. Daha yakın zamanda, Azalan maliyetler ve daha az teknik zorluklar mevcut muhabir hatları sayısında dramatik bir artış yol açmıştır. Transgenik araçların ve muhabir hayvanların mevcudiyeti büyümeye devam ederken, fluoresan tabanlı hücre sıralama yöntemlerinin kullanışlılığı ve uygulanabilirliğini de gerekir.
Son zamanlarda transgenik hayvanlardan gelen hücrenin, hücre kültürünü7‘ ye hazırlanırken primer nöronları arındırmak için rutin olarak uygulanacağını göstermiştir. Ya fareler veya fareler hücreleri sıralayarak, biz izole ve kültür floresan nöronlar, hangi gabaergic ya da glutamaterjik nöronlar özellikle floresan Reporter proteinleri ifade başardık6,8,9. Bu saflaştırılmış nöronal kültürler inceleyerek, biz gabaergic ve glutamaterjik nöronlar sinaptik iletim kurulması için glia-salgılanmış faktörlere bağlı şekilde önemli bir fark belirlemek başardık7. Ayrıca, saflaştırılmış nöronlar ile glial hücreler Co-kültür tarafından, biz, glial hücrelerin büyüme ve nöronların hayatta kalması kritik rolü gösteren önceki gözlemler uzatmak başardık10,11. Böylece, hücre sıralama ve hücre kültürünün bir kombinasyonu ile, biz izolasyonda spesifik nöron türlerinin gelişimini sadece çalışma başardık, ancak glial hücrelerin işlevlerinde etkisini araştırmak başardı.
Burada, transjenik fareler veya fareler korteks ve hipokampus gabaergic ve glutamaterjik nöronların arıtma ve kültürü için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca Geissler ve ark.12‘ den uyarlanmış, saflaştırılmış nöronlar ve glial hücrelerin temas olmayan ortak kültürü için bir yöntem sunuyoruz. Saf Gabaerınjik kültürler oluşturmak için, biz VGAT-Venus-A Wistar Rats8 veya Vgat-Venus fareler13, seçici bir Gelişmiş Sarı floresan protein varyantı (Venüs) ifade floresan nöronlar sıralanmış var > 95% kortikal GABAerjik nöronlar. Arıtılmış glutamaterjik kültürler oluşturmak için, biz nexcre gelen floresan nöronlar sıralanmış var; AI9 fareler6,9, hangi hızlı tdtomato kortikal glutamaterjik nöronlar. Tüm sıralama ve kültür prosedürü 3-4 h içinde yapılabilir ve elektrofizyolojik, morfolojik ve hücre hayatta kalma analizi için uygun yüzlerce çoğaltmak kültürler oluşturmak için kullanılabilir. Yöntem basit, tekrarlanabilir ve% 97 ‘ den büyük olan saflaştırılmış nöronal kültürler elde edebilirsiniz hücre türü ilgi için saf.
Burada sıralama ve primer nöronların yetiştirme birleştiren bir yöntem saf nöronal hücre kültürlerini oluşturmak için tarif. Bu yöntem yaklaşık alır 1 normal birincil Disosiye nöronal kültür protokolünden daha uzun saat henüz belirli nöronal türleri içeren çoğaltmak kültürler yüzlerce nesil için izin verir. En az 16 gün boyunca izolasyonda yetiştirilen, akons ve dendritler uzatmak ve eylem potansiyelleri tekrarlayan trenler ateş edebilir saflaştırılmış nöronlar (Şekil 2 ve Şekil 3). Daha da önemlisi, bu hücreler, elektrofizyolojik, morfolojik ve hayatta kalma analizleri de dahil olmak üzere düzenli primer kesilmeli nöronal kültürler gibi aynı deneysel analizlere imkan tanır. Bu saflaştırılmış kültürlerle çalışmanın büyük bir yararı, spesifik hücre türlerinin gelişiminin izolasyonda incelenmesini sağlarken. Saflaştırılmış kültürlerin gelişimini desteklemek için, ayrıca glial hücrelerle birlikte arıtılmış nöronlar için bir protokol sunuyoruz. Daha önce gösterildiği gibi, glial hücreler ile saf nöronlar yaşam, büyüme geliştirir ve ağ oluşumu yükseltebilirsiniz7 (Şekil 4). Böylece, burada daha fazla glia-nöron etkileşimleri çalışma ve geliştirme ve ilgi diğer hücre türleri arasındaki etkileşimi incelemek için yararlı olabilir gerektiğini gösteren yöntemlerin bir kombinasyonu sunuyoruz.
Saflaştırılmış glutamatergik nöronların kültürlerinde yapılan çalışmalar, glial hücrelerin nöronal ağlar ve sinapse oluşumunun gelişimini teşvik eden faktörleri salgılaştırması yönünde temel Öngörüler ortaya koymuştur16,17,18 . Genel olarak, spesifik nöron türleri arındırma için yöntemler daha başarıyla glutamaterjik nöronlar yerine gabaergic nöronlar gelişimini incelemek için uygulandı. Bu, bu iki hücre türünün nasıl gelişebilmesini anlayışımızda bir eşitsizlik yol açmıştır. Bu gabaergic ve glutamaterjik nöronların anatomi, fizyoloji ve gelişimsel kökenleri açısından önemli ölçüde farklılık göz önüne alındığında, biz kendi sağ GABAerjik nöronlar çalışması, daha iyi onların fonksiyon ve fizyolojisi anlamak için hayati önem taşımaktadır. Burada sunulan protokolü kullanarak, daha önce gabaergic ve glutamaterjik nöronların sinaptik iletim7kurulması için glia-salgılanmış etkenlere bağlı şekilde önemli farklar tespit ettik. Bu protokol yayımlayarak, başkalarının nöronlar ve glial hücreler arasındaki önemli etkileşimler daha fazla anlayış yapabilirsiniz umuyoruz.
Bu protokolde, biz farklı transgenik kemirgen hatları gabaergic veya glutamaterjik nöronları arındırmak için kullanılan bir akış sitometri tabanlı hücre sıralama yöntemi, tarif. Venüs pozitif GABAerjik nöronlar vgat Venüs fareler sıralanır13 veya Rats8 ve tdtomato pozitif glutamaterjik nöronlar nexcre sıralanır; AI9 fareler (aslen NexCre9 ve AI9 Reporter Lines6‘ dan yetiştirilen, bkz: türko ve al., 20187). Son yıllarda, teknolojik gelişmeler nedeniyle, transgenik hayvanların üretimi önemli ölçüde daha kolay hale gelmiştir. Bu nedenle, birçok farklı hücre tiplerinde, floresan molekülleri ifade hayvanların kullanılabilirliği hızla büyüdü. Bu, sırayla, floresan aktif hücre sıralamanın kullanımını ve uygulanabilirliğini artırmıştır. İlgi hücreleri izole etmek için alternatif yöntemler şu anda var16,19,20, onlar biraz doğal yüzey meydana gelen uygun antikorların kullanılabilirliği üzerinde bağımlılığı tarafından engellenmektedir Antijen. Bu, floresan tabanlı hücre sıralama yöntemleri ile karşılaştırıldığında, zaten mevcut olan birçok hücreye özgü transgenik muhabir hayvanlardan hücreleri sıralamak için kullanılabilecek çok yönlülüğünü sınırlar. Yine de, optimize edildiğinde, antikor tabanlı sıralama yöntemleri hızlı ve yüksek verim olabilir ve hatta daha iyi hücre anatomisini korumak, kendi akons ve dendritler bozulmamış21ile hücrelerin arıtma izin vererek. Bu nedenle bir sıralama stratejisine karar verirken antikor sıralama yöntemleri yine de dikkate alınmalıdır. Sonuçta, ilgi hücre türü, hangi hücrelerin sıralanacağı yaş, transgenik hayvanların veya yüzey antijenlerinin kullanılabilirliği ve gerekli hücre sayısı en uygun sıralama stratejisini seçerken belirleyici faktörler olacaktır.
Floresan tabanlı hücre sıralama hücreleri arındırmak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem olmasına rağmen, hücre kalitesini korumak için protokolün belirli adımlar sırasında bakım alınmalıdır. Örneğin, her santrifüjleme adımının ardından, hücre Pelet mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yeniden askıya olduğundan emin olmak önemlidir ve hücreler başarıyla kurtarıldı. Bazen, hücre Pelet supernatant çıkarmadan rahatsız edilebilir. Bu nedenle, santrifüjleme adımları arasında, mikroskobun altındaki hücrelerin varlığını kontrol etmek için herhangi bir kapsamlı hücre kaybını göz ardı etmek tavsiye edilir. Hücre kaplamasını takiben, hücrelerin beslenmeden önce en az 1 saat uymasına izin verilmelidir. Hücreler çok erken besleniyorsanız, bazı hücreler coverslip ‘dan çıkmış olabilir, böylece kültür yoğunluğunu azaltır. Kültür 1 saat sonra, hücre sağlığını değerlendirmek için akıllıca olduğunu. Hücreler sağlıklı görünmüyorsa ( Şekil 2a‘da sağlıklı hücrelerin bir örneği gösterilir) veya önemli hücre ölümü varsa, bu, ayrışma veya sıralama prosedürü sırasında bir sorunun belirtisi olabilir. Herhangi bir hücre türü kültür, daha önemli bir göz, hücre kültürü medya yönetirken dikkatli olmaktır. NBA medyası, pH göstergesi22olarak hareket eden fenol kırmızısı içerir. Eğer medya çok sarı renkte olur, o zaman bu pH çok asidik olduğunu gösterir; medya çok pembe olur, o zaman bu çözümün çok alkalin olduğunu gösterir. Stok çözümleri uzun süreler için açık, özellikle konik borular içine seyreltilmemeli medya, zaman içinde daha alkalin olma eğilimindedir. Bu nedenle her hafta ve komple medya her iki hafta taze komple NBA medya yapmak için tavsiye edilir (atmosferik koşullar altında orta tamponlar ve bu nedenle daha istikrarlı olmalıdır). Bu noktaları dikkate alarak, hücre sıralama ve hücre kültürü ekipmanına erişimi olan herhangi bir laboratuvarda arıtılmış hücre kültürlerini kurmak mümkün olmalıdır.
Deneylerimizin çoğunda, tek bir hayvandan arındırılmış kültürler üretiyoruz. Ancak, biyokimyasal analizler için hücreleri arındırırken, sıralama için birden fazla hayvanı birlikte havuza almak gerekebilir. Biz başarıyla yukarıda protokol (veri gösterilmez) kullanarak 8 embriyonik fareler (embriyonik gün 13 hayvan) kadar sıralanır. Ancak, daha fazla hayvan sıralanacak ise, doku miktarında artış karşılamak için her iki papain ve BSA çözeltileri (2.1.1-2.1.4 adımda açıklanan) hacmi artırmak için gerekli olabilir. Ayrıca, daha fazla hücre kültürde kaplama ise, daha sık bir beslenme programı gerekebilir. Bir başlangıç noktası olarak, hücreler her 7 günde bir 100 μL tarafından ayarlanabilir medya kaldırarak ve 200 μL taze komple NBA medyası ekleyerek beslenebilir. Nöron viability uğruna, daha fazla hayvan sıralama ise, mümkün olduğunca sıralama süresini minimize etmek için düşünce verilmelidir. Bu genellikle arıtılmış hücrelerin verimli kullanımı için aşağı akış analizlerinin dikkatli optimizasyonu gerektirir. Biz rutin olarak sıralanmış fare nöronlar 600 olaylar/s, en fazla 500,000-800.000 hücre hayvan başına (postnatal gün 0 – 2) oranlarında. Ancak, bu sıralama hızları ve koşulları kapsamlı optimizasyon olmadan oldu. Bu nedenle, sıralama hızı ve verim daha fazla iyileştirmeler mümkün olmalıdır.
Saflaştırılmış nöronlar onların hayatta kalması için glia-Klima medya gerektirir. Bu daha önce glial Klima medya ile nöronlar tedavi etmeden önce, ayrı olarak, nöronlar ve glial hücreler kültür tarafından gösterilmiştir10. Bizim deneylerde, biz hücre kültürü plaka içine yerleştirilir yarı geçirgen hücre kültürü ekler, glial hücreler kültür tarafından saflaştırılmış nöronlar desteklemek için seçti. Bu yöntem, glia türevi ekstrellüler matris proteinleri ve nöronlar12ile etkileşimi çalışmak için başarıyla uygulandı. Kişi olmayan, ancak bu yöntem tarafından sağlanan sürekli destek hücrelerin ayrı kültüre kıyasla bir dizi avantaj vardır. En önemlisi, nöronlar ile glial hücrelerin Co-Culture sürekli düzenleme ve hücre kültürü medya, daha yakından in vivo duruma benzeyen Klima sağlar. Buna ek olarak, hücrelerin sürekli ortak kültürü, ayrı kültürlerde mümkün olmayan nöronlar ve glia arasında sinyal alma olasılığı sağlar. Protokolümüzde, gerekirse sürekli Co-Culture yöntemi kolayca atlanabilir ve glia-Klima medya ile nöronların klasik tedavisi gerçekleştirilebilir.
Özetle, burada sunulan protokol kendi saflaştırılmış hücre kültürü deneylerini kurabilen sağlam bir temel ile okuyucu sağlamayı amaçlamaktadır. Transgenik hayvanların ve viral yapıların mevcudiyeti, öngörülebilen gelecek için artmaya devam edeceğini tahmin ediyoruz. Bu nedenle, floresan dayalı hücre sıralama teknikleri daha yaygın olarak kullanılan ve değerli olması muhtemeldir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Jenny Kirsch ve ana Teichmüller tarafından akış cytometry çekirdek tesisi, Deutsches Rheuma-FORSCHUNGSZENTRUM, Berlin ‘de sağlanan mükemmel teknik desteğe teşekkür etmek istiyor. Hayatta kalma analizine yardım etmesi için Jie Song ‘a teşekkür etmek istiyoruz. Biz de onun yardımcı olmak için Rita Loureiro teşekkür etmek istiyorum floresan fareler ve Hıristiyan Ebner görüntülerini yakalama protokolünün kritik okuma için. VGAT-Venus transjenik fareler, Dr. A. Miyawaki tarafından sağlanan pCS2-Venus kullanarak, Ulusal Fizyolojik Bilimler Enstitüsü, Okazaki, Japonya ‘da DRS. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi ve Y. Kawaguchi tarafından üretildiler. Bu çalışma Alman Araştırma Konseyi (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 ila IV) tarafından destekleniyordu.
Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
Trypsin / EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | – | Used for trituration of cells |
24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | – |
15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | – |
Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | – |
35 mm Petri dish | Corning | 353001 | – |
100 mm Petri dish | Corning | 353003 | – |
30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
Spatula (130 mm long / 5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | – | To cell count dissociated cells |
Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |