Cultura de células primárias de neurônios Gabaérgicos ou glutamatérgicos purificados estabelecidos através da triagem de células ativadas por fluorescência

Todos os procedimentos e manutenção animal foram realizados de acordo com as orientações institucionais, a lei alemã de bem-estar animal e a Directiva 86/609/CEE do Conselho Europeu relativa à protecção dos animais, na presença de autorizações de competentes (LaGeSo Berlin, T-0215/11). Nota: Este protocolo descreve a cultura de neurônios purificados de um único rato transgênico ou filhote de rato (dia pós-natal 0 – 2). Todas as técnicas devem ser executadas condições estéreis. Todas as soluções devem ser esterilizadas utilizando um filtro de 0,2 μm (ver tabela de materiais). As lamelas de vidro e as ferramentas da dissecção devem ser calor sterilized para 3 h em 185 ° c. 1. revestimento de vidro COVERSLIP com poli-L-lisina Prepare as coberturas de vidro descongelando uma alíquota de 5 mL de solução de 200 μg/mL de poli-L-lisina (PLL). Diluir esta solução de stock para 20 μg/mL adicionando 45 mL de água de grau de injecção pura. Filtrar-esterilizar a solução para um novo tubo cônico de 50 mL. Rotule este tubo como “PLL estéril”.Nota: Use água armazenada à temperatura ambiente para acelerar o processo de descongelação. Adicione 100 coberturas de vidro estéreis, redondas e de 12 mm à solução PLL estéril. Agitar o tubo a cada 5 – 10 min, por 2 – 3 min, para garantir até mesmo o revestimento. Cubra os lamínulas desta forma durante 1 h.Nota: Os COVERSLIP de vidro redondos alemão-manufacturados (diâmetro = 12 milímetros) são preferidos, porque fornecem uma superfície de confiança da cultura e cabem facilmente nos poços de uma placa da cultura da pilha 24-well. Após 40 min de revestimento de PLL, tome 2 partes de papel de tecido e coloque-os horizontalmente no armário do fluxo. Esterilizar o papel usando 70% etanol, em seguida, aplainar para remover vincos e deixar secar. Após o revestimento das coberturas de vidro para 1 h com PLL, remova a solução adicional de PLL e adicione a água estéril da classe da injeção. Agitar suavemente os lamínulas para 2 – 3 s para permitir a remoção do excesso de PLL. Repita esta etapa de enxaguadela 2 vezes adicionais. Retire o excesso de água e, em seguida, transfira os lamínulas para o papel de tecido estéril. Separe cuidadosamente cada lamínula usando fórceps curvo e deixe secar.Nota: Os COVERSLIP que não separam facilmente podem ser descartados. Alternativamente, uma pequena quantidade de água pode ser adicionada para ajudar na separação. Uma vez que seco, transfira os COVERSLIP a uma placa da cultura de 24 poços.Nota: As coberturas devem ser feitas prontas aproximadamente 30 min – 1 h antes de iniciar o processo de dissecção. As placas podem ser armazenadas em uma incubadora a 37 ° c e 5% CO2 até necessário. 2. dissociação do hipocampal e do tecido cortical Preparação de soluções de cultura celular Para a dissociação do tecido neural, primeiro degelo uma alíquota de 40 mL de buffer de cultura celular (composição [em mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 NaH2po4, 1 MgSO4· 7h2o, 1 CAcl2· 2h2o, 0,5 EDTA · 2Na · 2H2O e 25 D-glicose, pH = 7,4). Medir 12 mL de tampão de cultura celular para um tubo cônico de 15 mL; rótulo como “BSA”. Medir 5 mL de tampão de cultura celular para um tubo de 15 mL diferente; rótulo como “papaína”. Incubar os dois tubos num banho de água durante 15 min a 37 ° c. Filtro-esterilize o amortecedor restante da cultura da pilha, etiqueta como “amortecedor-estéril” e armazene-o em 4 ° c até que exigido. Pesar 120 mg de albumina sérica bovina (BSA) e adicionar ao tubo rotulado “BSA”. Pesar 7 mg de papaína e adicionar ao tubo rotulado “papaína”. Retorne os dois tubos para o banho de água por 15 min.Nota: É útil adicionar uma pequena quantidade de tampão para o barco de pesagem para facilitar a transferência do pó de papaína. Uma vez que todos os pós dissolvidos, filtre-esterilize cada solução a um tubo cônico de 15 mL fresco. Para o papain do tubo, rotule a solução filtrada como o “Papain-estéril”. Para o tubo BSA, divida a solução estéril de BSA em 3 tubos, cada um contendo 4 mL de solução de BSA. Rotule cada tubo como “BSA-estéril” e “1”, “2” ou “3”. Retorne todos os tubos de volta ao banho de água e continue a incubar em 37 ° c até que exigido. Preparação para dissecção tecidual Pegue um único pedaço de papel de filtro de 35 mm (ver tabela de materiais) e esterilize com 70% de etanol; Deixe secar na tampa de um prato de Petri de 100 mm, em um armário de fluxo. Colocar para fora a tesoura, fórceps, bisturi e espátula (ver tabela de materiais) necessários para a dissecção do hipocampo e córtex. Coloque 2 35 mm de placas de Petri e um prato de Petri de 100 mm contendo papel de filtro estéril em um local acessível no centro do gabinete de fluxo. Coletar NexCre transgênicos; Ai9 e VGAT Venus mouse filhotes que devem ser dissecados. Use uma lâmpada fluorescente com os filtros apropriados da excitação e da emissão (veja a tabela de materiais) para discriminar filhotes de cachorro fluorescentes do tipo selvagem littermates. Imediatamente antes de dissecação de animais, encha cada prato de Petri de 35 mm com tampão de cultura celular refrigerado e estéril.Nota: Um prato de Petri é para limpar as ferramentas entre as dissecções, e o outro é para coletar o hipocampo e o córtice. Dissecção tecidual Assim que o buffer de cultura celular é derramado, decapitar um dia pós-natal 0 – 2 rato transgênico ou filhote de rato usando grande, tesoura afiada e usar um estéril 100 mm prato de Petri para transferir a cabeça para o gabinete de fluxo. Use fórceps, tesouras e uma espátula para transferir cuidadosamente o cérebro de um filhote transgênico para o papel de filtro estéril. Use um bisturi tipo 22 para dissecar o cerebelo e separar os 2 hemisférios. Use uma pequena espátula para rolar os hemisférios lateralmente. Em cada hemisfério, pressione suavemente para que o córtex entra em contato com o papel de filtro. Mova suavemente as regiões do meio-cérebro para revelar o hipocampo e o córtex.Nota: Tenha cuidado para não aplicar demasiada pressão ao pressionar para baixo nos hemisférios ou células pode tornar-se esmagado. Use um bisturi ou espátula para separar o hipocampo e o córtex de cada hemisfério. Transfira o tecido dissecado para um prato de Petri de 35 mm contendo tampão de cultura de células refrigeradas.Nota: Se dissecando vários animais, armazene o tampão estéril da cultura de pilha em um tubo cônico de 50 mL no gelo. Após cada dissecção, transfira o tecido dissecado ao amortecedor da cultura de pilha refrigerada. Após a dissecção bem sucedida do tecido cortico-hippocampal, transfira a solução estéril do papaína do banho de água ao armário do fluxo. Use uma pipeta Pasteur de 3 mL para transferir o hipocampo e o córtice dissecados à tampa de um prato de Petri estéril de 35 milímetros. Pique em um movimento cruzado, usando a parte plana de um bisturi tipo 22, até que o tecido esteja em pedaços pequenos. Use uma pequena quantidade de solução de papaína para transferir o tecido picado da tampa do prato de Petri para o tubo de papaína estéril. Devolver o tubo de papaína ao banho de água e incubar o tecido a 37 ° c durante 25 min. Durante a incubação do papaína, compo a solução completa dos meios da fluorescência. Descongelar uma alíquota de 1 mL de B27, uma alíquota de 0,5 mL de Glutamax e uma alíquota de 0,5 mL de Pen-Strep. Alíquota 48,5 mL de hibernação um meio de fluorescência baixo para um tubo cônico de 50 mL. Adicione B27, Glutamax e Pen-Strep à solução. Agitar a solução bem, em seguida, filtrar-esterilizar e rótulo como “Hibernate A mídia completa” (com data e iniciais). Incubar a 37 ° c num banho de água. Após a incubação do papaína, transfira o papaína-tubo e os BSA-tubos estéreis ao armário do fluxo. Use uma pipeta de 1 ml Pasteur para remover somente o tecido cortico-hippocampal do tubo do papaína no BSA-tubo 1.Nota: Tome cuidado para minimizar a transferência de solução de papaína em excesso. Dissociação de células A fim de romper qualquer grande aglomerados de tecido, triturar o tecido várias vezes usando uma 1 mL pipeta Pasteur. Depois disso, triturar o tecido 7 vezes usando uma ponta fina pipeta Pasteur. Deixe o tecido para ficar por 30 s, permitindo que pedaços maiores de tecido para sedimento. Após 30 s, transfira o 1 mL mais baixo da solução e do tecido do BSA-tubo 1 ao BSA-tubo 2. Triturar o tecido em BSA-Tube 2 várias vezes usando uma ponta fina pipeta Pasteur. Após a trituração, transfira outra vez os 1 mL mais baixos do tecido e da solução de BSA-tubo 1, mas agora a BSA-tubo 3. Triturar o tecido em BSA-tubo 3 várias vezes usando uma ponta fina pipeta Pasteur. Após a trituração, transfira toda a solução e o tecido dos tubos 2 e 3 no BSA-tubo 1. Triturar mais 2-3 vezes e centrifugar a 3.000 x g durante 3 min. Durante A centrifugação, compõem A mídia neural basal A completa (mídia da NBA). Alíquota 48,5 mL de mídia da NBA para um tubo cônico de 50 mL e incubar a 37 ° c em um banho de água. Rotule este tubo “NBA apenas”. Além disso, descongelar uma alíquota de 1 mL de B27, uma alíquota de 0,5 mL de Glutamax e uma alíquota de 0,5 mL de Pen-Strep à temperatura ambiente. Após a centrifugação, Retire cuidadosamente o sobrenadante do tecido peletizado e Resuspenda as células em 2 mL de suportes completos. Use uma pipeta P1000 para triturar o tecido para cima e para baixo 20 vezes.Nota: Tome cuidado para não pipeta as células muito vigorosamente. Se for aplicada demasiada pressão, as células podem ficar danificadas. Use uma pipeta Pasteur de 1 mL para filtrar a suspensão da célula através de uma peneira de célula de 30 μm em um tubo de amostra de poliestireno.Nota: Se a suspensão celular não passar imediatamente através da peneira celular, pode ser necessário pressionar em cima da peneira com uma luva estéril para iniciar o fluxo. Este passo importante impede o entupimento do classificador de células. Para a coleta de neurônios após a triagem, preparar tubos de coleta por pipetagem 300 μL de mídia completa para o número necessário de tubos de polipropileno. A suspensão celular está agora pronto para ser levado para o classificador de células para a triagem. Pegue a suspensão celular, tubos de coleta extra e peças de reposição de mídia completa em caso de diluição da amostra é necessária. 3. triagem celular de neurônios Gabaérgicos ou glutamatérgicos purificados Nota: Para minimizar a possibilidade de contaminação bacteriana durante a triagem enxaguar o tubo da amostra do classificador com etanol 70% por pelo menos 5 min antes da triagem. Os parâmetros de ordenação detalhados variam entre os instrumentos, considerações fundamentais são as seguintes. Durante o primeiro tipo de célula, estabeleça níveis de fluorescência de fundo de células não rotuladas classificando e comparando células de um animal selvagem. Para cada tipo de célula fluorescente a ser classificada, escolha os filtros de excitação e emissão apropriados. Excite Venus e TdTomato proteínas usando 488 nm ou 531 nm comprimentos de onda de excitação, respectivamente. Detecte a luz emitida através dos conjuntos de filtros de emissão 530/40 e 575/30, respectivamente. Adicione tubos de coleta de polipropileno, contendo 300 μL de mídia completa, ao classificador de células para coleta de células. Para a pureza elevada, classifique pilhas fluorescentes brilhantemente etiquetadas (veja Figura 1b por exemplo parcelas do ponto de pilhas classificadas). Após a classificação, para obter resultados ideais, realize um teste de pureza das células classificadas para estimar os níveis de pureza. Observe que a taxa de recuperação típica de células após a classificação é entre 70 – 80%. Anote o número de células classificadas em cada tubo de coleta. Esse valor é dado pelo instrumento de classificação da célula.Nota: A triagem de células pode ser realizada usando um bocal de 70 μm (pressão de fluido de bainha de 70 psi) ou um bocal de 100 μm (pressão de fluido de bainha de 20 psi). 4. cultivo de neurônios classificados Após a triagem celular, transfira as células coletadas para 2 mL de tubos de centrífuga de fundo redondo, usando uma pipeta Pasteur de 1 mL. Centrifugue as células em 3.000 x g por 3 min para formar um pellet celular.Nota: Para ajudar a identificar a localização do pellet celular, orientar os tubos de centrífuga de fundo redondo com a dobradiça da tampa voltada para fora, o que permite que o pellet célula para formar na parte de trás do tubo de centrífuga (ou seja, no mesmo lado do tubo como a dobradiça). Durante a centrifugação, adicione 1 mL de B27, 0,5 mL de Glutamax e 0,5 mL de Pen-Strep a 48,5 mL de mídia pré-aquecida da NBA. Agitar bem a solução, em seguida, filtrar esterilizar e rótulo como “NBA Complete Media” (com data e iniciais). Retorne ao banho de água até que exigido. Após a centrifugação, utilize uma pipeta Pasteur de 1 mL para transferir o sobrenadante para um tubo de centrifugação diferente (manter o sobrenadante Incase que a pelota da célula foi perturbada). Re-suspender a pelota da pilha na quantidade exigida de meios completos pre-warmed de NBA para conseguir uma densidade da pilha de 1.000 Cells/μL. re-suspender as células por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta P200 ou P1000. Para confirmar a presença de células dissociadas, verifique a solução celular um microscópio, usando uma lente objetiva de 4x ou 10x. Alternativamente, Pipetar uma pequena quantidade de solução celular para uma lamínula e verificar o microscópio. Se um grande número de células estiver presente, o sobrenadante da etapa 4,3 pode ser Descartado. Antes de galvanizar as células, vórtice em uma velocidade média de 2 – 3 s para garantir uma suspensão celular mesmo. Após o vortexing, pipeta rapidamente 10 μL da suspensão da pilha ao centro de cada lamínula. Após a pipetagem das células, retorne rapidamente cada placa para a incubadora (5% CO2/37 ° c) e incubar por 1 h.Nota: Se a adição de células a várias placas de 24 poços, garantir até mesmo densidades de célula por células vortexing entre as placas. Após 1 h, alimente as células com 500 μL de mídia NBA completa pré-aquecida e retorne à incubadora.Nota: Ao alimentar as células, é importante para a pipeta a mídia suavemente para baixo do lado do poço para evitar o descolamento da célula. Para experimentos curtos (< 16 dias), a alimentação na densidade acima não é necessária. Ao galvanizar uma maior densidade de células, intervalos de alimentação mais freqüentes podem ser necessários (ver discussão). 5. astrocyte enriquecido glial culturas de apoio Nota: A produção de culturas glial14 e o uso de inserções da cultura da pilha foram descritos previamente12. Em resumo, as culturas enriquecidas do glia do astrocyte são derivadas do tecido cortico-hippocampal (com os meninges removidos; P2 – P5), que foram cultivadas por uma semana em uma placa de 6 poços revestida com PLL de 20 μg/mL, em meio de DMEM suplementado com soro. Para cocultura de neurônios purificados e células gliais, a passagem de células gliais confluentes para o número necessário de inserções de cultura celular (0,4 μm tamanho dos poros — ver tabela de materiais). Para passar as células, retire uma placa de 6 poços contendo células gliais confluentes da incubadora e lave 2 cavidades, 2 vezes, com 2 mL de soro pré-aquecido (37 ° c) com tampão de fosfato (PBS). Aspirar a solução de PBS e usar uma pipeta P1000 para adicionar 1 mL de Trypsin pré-aquecido (37 ° c) (1:250)/EDTA (0,25%/0,02%) solução para cada poço. Retorne a placa 6-well à incubadora e verific cada 2 – 3 minutos para o destacamento da pilha. Uma vez que o destacamento significativo da pilha ocorreu, pipeta as pilhas e a solução da pilha delicadamente acima e para baixo usando uma pipeta fina da ponta Pasteur, para ajudar um destacamento e uma separação mais adicionais de pilhas individuais. Transfira a solução celular para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 3.000 x g durante 3 min. Re-suspender as células usando uma pipeta P1000 em 5 mL de pré-aquecido (37 ° c) NBA completa de mídia através de pipetagem suavemente para cima e para baixo até que o pellet célula está em solução. Realize uma contagem de células usando um de ou um contador de células automatizado.Nota: Após 7 dias na cultura, aproximadamente 750000-1000000 as pilhas podem ser colhidas de cada poço de uma placa de 6 poços. Placa 40.000 células gliais para cada inserção de cultura celular em uma gota de 500 μL (80 células/μL). Depois de permitir que as células aderiram por 1 h, use fórceps estéril para transferir inserções de cultura de células cobertas de glial para 24 placas bem contendo neurônios purificados. Remova o excesso de mídia da superfície das inserções de cultura de célula (aproximadamente 300 μL).Nota: Porque as bolhas de ar podem frequentemente começ prendidas abaixo das inserções da cultura da pilha, pode ser necessário inclinar delicadamente as inserções para desalojar estas bolhas. Se mais células gliais forem adicionadas à inserção da cultura celular, mais etapas de lavagem e centrifugação podem ser necessárias para remover o excesso de tripsina, o que pode ser prejudicial para a sobrevivência celular.