JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Primaire cel cultuur van gezuiverde erge of glutamaterge neuronen opgericht door fluorescentie-geactiveerde cel sorteren

Published: June 06, 2019
doi:
10.3791/58974
, , , ,
1Institut für Integrative Neuroanatomie, Charité,Universitätsmedizin Berlin, 2Department for Cytometry and Cellsorting, German Rheumatism Research Center,Leibniz Institute, 3Departments of Genetic and Behavioral Neuroscience,Graduate School of Medicine, Gunma University

Summary

Dit protocol beschrijft een cel Sorteren gebaseerde methode voor de zuivering en cultuur van fluorescerende erge of glutamaterge neuronen uit de neocortex en Hippocampus van postnatale muizen of ratten.

Abstract

Het algemene doel van dit protocol is het genereren van gezuiverde neuronale culturen afgeleid van ofwel erge of glutamaterge neuronen. Gezuiverde neuronen kunnen worden gekweekt in gedefinieerde media voor 16 dagen in vitro en zijn vatbaar voor alle analyses meestal uitgevoerd op gescheiden culturen, met inbegrip van elektrofysiologische, morfologische en overlevings analyses. Het grote voordeel van deze culturen is dat specifieke soorten cellen selectief kunnen worden bestudeerd bij afwezigheid van complexe externe invloeden, zoals die welke voortvloeien uit glial cellen of andere neuron types. Bij de planning van experimenten met gezuiverde cellen, echter, is het belangrijk op te merken dat neuronen sterk afhankelijk van glia media voor hun groei en overleving. Bovendien glutamaterge de neuronen verder van glia-afgescheiden factoren voor de totstandbrenging van synaptische transmissie af. Wij beschrijven daarom ook een methode voor co-kweken neuronen en glial cellen in een non-contact regeling. Met behulp van deze methoden, hebben we geïdentificeerd grote verschillen tussen de ontwikkeling van erge en glutamaterge neuronale netwerken. Zo, het bestuderen van culturen van gezuiverde neuronen heeft een groot potentieel voor het bevorderen van ons begrip van hoe het zenuwstelsel ontwikkelt en functioneert. Bovendien kunnen gezuiverde culturen nuttig zijn voor het onderzoeken van de directe werking van farmacologische agentia, groeifactoren of voor het onderzoeken van de gevolgen van genetische manipulaties voor specifieke typen cellen. Naarmate meer en meer transgene dieren beschikbaar komen, etikettering van extra specifieke soorten van belang, verwachten we dat de protocollen hier beschreven zal groeien in hun toepasbaarheid en potentieel.

Introduction

Het sorteren van cellen is een krachtig hulpmiddel voor het isoleren van levende cellen van belang van een heterogene mengeling van cellen. Cellen kunnen worden gesorteerd op basis van grootte en vormcriteria, evenals de expressie van TL-markeringen1,2. Vaak, worden de fluorophore-geconjugeerde antilichamen gebruikt om verschillende cel types te etiketteren door cel-specifieke oppervlakte antigenen te richten3,4. Alternatief, transgene dieren of virale leveringssystemen zijn ontworpen om fluorophores uit te drukken onder cel-specifieke promotors5,6. Historisch gezien was de ontwikkeling van transgene hulpmiddelen en dieren kostbaar en tijdrovend. Meer recentelijk, dalende kosten en minder technische problemen hebben geleid tot een dramatische toename van het aantal beschikbare reporter lijnen. Aangezien de beschikbaarheid van transgene hulpmiddelen en verslaggever dieren blijft groeien, zo ook moet het nut en de toepasbaarheid van fluorescentie-gebaseerde cel sorteermethoden.

We hebben onlangs aangetoond dat het sorteren van cellen van transgene dieren routinematig kan worden toegepast op primaire neuronen te zuiveren in de voorbereiding van de cel cultuur7. Door cellen van één van beide ratten of muizen te sorteren, konden wij fluorescente neuronen isoleren en van de cultuur, die fluorescente verslaggever proteïnen specifiek in of erge of glutamaterge neuronen6,8,9uitdrukken. Door het bestuderen van deze gezuiverde neuronale culturen, waren we in staat om een belangrijk verschil in de manier waarop erge en glutamaterge neuronen afhangen van glia-afgescheiden factoren voor de oprichting van synaptische transmissie7te identificeren. Bovendien, door co-kweken glial cellen met gezuiverde neuronen, waren we in staat om uit te breiden op eerdere waarnemingen waaruit blijkt dat de kritische rol die glial cellen spelen in de groei en overleving van neuronen10,11. Aldus, door een combinatie van cel het sorteren en de cultuur van de cel, konden wij niet alleen de ontwikkeling van specifieke neuron types in isolatie bestuderen, maar konden de invloed van glial cellen op hun functie onderzoeken.

We presenteren hier een protocol voor de zuivering en de cultuur van erge en glutamaterge neuronen uit de cortex en de hippocampus van transgene muizen of ratten. We presenteren ook een methode voor de non-contact co-cultuur van gezuiverde neuronen en glial cellen, aangepast van Geissler et al.12. Met het oog op gezuiverde erge culturen te genereren, hebben we gesorteerd fluorescente neuronen van VGAT-Venus-A Wistar Rats8 of VGAT-Venus muizen13, die selectief Express een versterkte gele fluorescerende eiwit variant (Venus) in > 95% van corticale erge neuronen. Voor het genereren van gezuiverd glutamaterge culturen, hebben we gesorteerd fluorescente neuronen uit NexCre; Ai9 muizen6,9, die uitdrukken tdTomato in corticale glutamaterge neuronen. De gehele sorteer-en cultuur procedure kan worden uitgevoerd binnen 3-4 uur en kan worden gebruikt om honderden replicerende culturen te genereren die geschikt zijn voor elektrofysiologische, morfologische en cel overlevings analyse. De methode is eenvoudig, reproduceerbaar en kan produceren gezuiverde neuronale culturen die groter zijn dan 97% puur voor de cel type van belang.

Protocol

Alle procedures en het onderhoud van dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtsnoeren, de Duitse wet op dierenwelzijn en de Europese Raad Richtlijn 86/609/EEG betreffende de bescherming van dieren, in de aanwezigheid van machtigingen van lokale autoriteiten (LaGeSo Berlin, T-0215/11). Opmerking: Dit protocol beschrijft de cultuur van gezuiverde neuronen van een enkele transgene muis of rat pup (postnatale dag 0 – 2). Alle technieken moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Alle oplossingen moeten worden gesteriliseerd met behulp van een 0,2 µm filter (Zie tabel van materialen). Glas-dekglaasjes en dissectie gereedschap moet warmte worden gesteriliseerd voor 3 uur bij 185 ° c. 1. coating glas-Dekglaasjes met poly-L-lysine Bereid glas-dekglaasjes door het ontdooien van een 5 mL hoeveelheid 200 µ g/mL poly-L-lysine (PLL) oplossing. Verdun deze voorraad oplossing tot 20 µ g/mL door toevoeging van 45 mL zuivere injectie grade water. Filter-Steriliseer de oplossing in een nieuwe 50 mL conische buis. Label deze buis als “PLL steriel”.Opmerking: Gebruik water opgeslagen bij kamertemperatuur om het ontdooi proces te versnellen. Voeg 100 steriele, ronde, 12 mm glas-dekglaasjes toe aan de steriele PLL-oplossing. Schud de tube om de 5 – 10 min, voor 2 – 3 min, om gelijkmatige coating te garanderen. Bedek de-dekglaasjes op deze manier voor 1 h.Opmerking: De Duits-vervaardigde ronde glas-dekglaasjes (diameter = 12 mm) hebben de voorkeur, aangezien zij een betrouwbare cultuur oppervlakte verstrekken en gemakkelijk in de putten van een 24-goed cel cultuur plaat passen. Na 40 min van PLL coating, neem 2 stukjes tissue papier en leg ze plat in de stroom kast. Steriliseer het papier met behulp van 70% ethanol, dan plat om plooien te verwijderen en te laten drogen. Na het coaten van de glazen-dekglaasjes voor 1 h met PLL, Verwijder overtollige PLL oplossing en voeg steriele injectie grade water. Schud voorzichtig de-dekglaasjes voor 2 – 3 s om het verwijderen van overtollige PLL mogelijk te maken. Herhaal deze spoeling stap 2 extra keer. Verwijder overtollig water, en breng de-dekglaasjes naar de steriele tissue papier. Apart elke dekglaasje met behulp van gebogen Tang en laat drogen.Opmerking: -Dekglaasjes die niet gemakkelijk gescheiden kunnen worden weggegooid. Alternatief, kan een kleine hoeveelheid water worden toegevoegd om scheiding te helpen. Eenmaal droog, breng de-dekglaasjes naar een 24-Well cultuur plaat.Opmerking: -Dekglaasjes moet worden gemaakt klaar ongeveer 30 min-1 uur voor aanvang van de dissectie proces. De platen kunnen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 worden opgeslagen tot vereist. 2. dissociatie van Hippocampale en corticale weefsel Voorbereiding van de Cell Culture Solutions Voor de scheiding van neurale weefsel, eerste defrost een 40 mL hoeveelheid cel cultuur buffer (samenstelling [in mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 Nah2po4, 1 MgSO4· 7H2o, 1 CaCl2· 2H2o, 0,5 EDTA · 2Na · 2H2O en 25 D-glucose, pH = 7,4). Maatregel uit 12 mL van de cel cultuur buffer tot een 15 mL kegelvormige buis; Label als “BSA”. Meet 5 mL cel cultuur buffer naar een andere 15 mL buis; Label als “papaïne”. Incubeer beide buizen in een waterbad voor 15 min bij 37 °C. Filter-Steriliseer de resterende cel cultuur buffer, label als “buffer-steriel” en op te slaan bij 4 ° c tot vereist. Weeg 120 mg van boviene serum albumine (BSA) en voeg toe aan de buis met het label “BSA”. Weeg 7 mg papaïne en voeg toe aan de buis met het label “papaïne”. Breng beide buizen terug naar het waterbad voor 15 minuten.Opmerking: Het is nuttig om een kleine hoeveelheid buffer toe te voegen aan de weeg boot om de overdracht van de papaïne poeder te vergemakkelijken. Zodra alle poeders zijn opgelost, filter-steriliseren elke oplossing om een verse 15 mL conische buis. Voor Tube papaïne, label de gefilterde oplossing als “papaïne-steriel”. Voor buis BSA, verdeel de steriele BSA oplossing in 3 buizen, elk met 4 mL BSA oplossing. Label elke buis als “BSA-steriel” en ofwel “1”, “2” of “3”. Terug alle buizen terug naar het waterbad en blijven incuberen bij 37 ° c tot de vereiste. Voorbereiding voor weefsel dissectie Neem een enkel stuk van 35 mm filtreerpapier (Zie lijst van materialen) en steriliseer met 70% ethylalcohol; laat drogen in het deksel van een 100 mm Petri schaaltje, in een stroom kast. Lay-out van de schaar, Tang, scalpel en spatel (Zie tabel van materialen) die nodig zijn voor de dissectie van de hippocampus en cortex. Plaats 2 35 mm petrischalen en een 100 mm petrischaaltje met steriel filtreerpapier op een toegankelijke plaats in het midden van de stromings kast. Het verzamelen van transgene NexCre; Ai9 en VGAT Venus muis pups die moeten worden ontleed. Gebruik een fluorescentielamp met aangewezen opwindings en emissie filters (Zie lijst van materialen) om fluorescente pups van wilde type nestgenoten te onderscheiden. Onmiddellijk voor het ontleden van dieren, vul elke 35 mm Petri schaaltje met gekoelde, steriele cel cultuur buffer.Opmerking: Een Petri schaaltje is voor het reinigen van de gereedschappen tussen de dissecties, en de andere is voor het verzamelen van de hippocampus en cortex. Weefsel dissectie Zodra de cel cultuur buffer wordt gegoten, onthoofden een postnatale dag 0 – 2 transgene muis of rat pup met behulp van grote, scherpe schaar en gebruik een steriele 100 mm Petri schaaltje om het hoofd over te dragen in de stroom kast. Gebruik een tang, een schaar en een spatel om zorgvuldig de hersenen van een transgene pup naar steriel filtreerpapier over te brengen. Gebruik een scalpel van het type 22 om de kleine hersenen weg te ontleden en de 2 halfronden te scheiden. Gebruik een kleine spatel om de halfronden lateraal rollen. Op elk halfrond, druk zachtjes, zodat de cortex in contact komt met het filterpapier. Voorzichtig bewegen middenhersenen regio’s naar de hippocampus en cortex onthullen.Opmerking: Wees voorzichtig niet te veel druk toe te passen bij het indrukken van de halfronden of cellen kunnen worden verpletterd. Gebruik een scalpel of spatel om de hippocampus en cortex scheiden van elk halfrond. Overdracht van ontleed weefsel naar een 35 mm Petri schaaltje met gekoelde cel cultuur buffer.Opmerking: Als het ontleden van meerdere dieren, op te slaan steriele cel cultuur buffer in een 50 mL kegelvormige buis op ijs. Na elke dissectie, overdracht ontleed weefsel naar de gekoelde cel cultuur buffer. Na succesvolle dissectie van cortico-hippocampale weefsel, breng de steriele papaïne oplossing van het waterbad aan het stroom kabinet over. Gebruik een pipet van 3 mL Pasteur om de ontledene Hippocampus en cortex naar het deksel van een steriel 35 mm Petri schaaltje over te brengen. Hak in een Criss-Cross beweging, met behulp van het platte deel van een type 22 scalpel, totdat het weefsel is in kleine stukjes. Gebruik een kleine hoeveelheid papaïne oplossing om het gehakte weefsel van het deksel van de Petri schaal naar de steriele papaïne buis over te brengen. Breng de papaïne buis naar het waterbad en Incubeer het weefsel bij 37 °C voor 25 min. Tijdens papaïne incubatie, make-up complete fluorescentie media oplossing. Ontdooi een hoeveelheid B27 van 1 mL, een hoeveelheid Glutamax van 0,5 mL en een hoeveelheid pen-keelontsteking van 0,5 mL. Hoeveelheid 48,5 mL slaapstand een lage fluorescentie media naar een 50 mL conische buis. Voeg B27, Glutamax en pen-keelontsteking aan de oplossing. Schud de oplossing goed, dan filter-steriliseren en labelen als “Hibernate een complete media” (met datum en initialen). Incubeer bij 37 °C in een waterbad. Na papaïne incubatie, breng de papaïne-buis en steriele BSA-buizen naar de stroom kast. Gebruik een pipet van 1 mL Pasteur om alleen het cortico-hippocampale weefsel uit de papaïne buis te verwijderen in BSA-Tube 1.Opmerking: Zorg ervoor dat de overdracht van overtollige papaïne oplossing te minimaliseren. Dissociatie van cellen Met het oog op het breken van alle grote bosjes van weefsel, fijnstampen het weefsel meerdere malen met behulp van een 1 mL Pasteur pipet. Na deze, fijnstampen het weefsel 7 keer met behulp van een fijne tip Pasteur pipet. Laat het weefsel te staan voor 30 s, waardoor grotere stukjes weefsel aan sediment. Breng na 30 s de onderste 1 mL oplossing en het weefsel over van BSA-Tube 1 naar BSA-Tube 2. Fijnstampen het weefsel in BSA-Tube 2 meerdere malen met behulp van een fijne tip Pasteur pipet. Na trituration, overdracht opnieuw lagere 1 mL van weefsel en oplossing van BSA-buis 1, maar nu aan BSA-buis 3. Fijnstampen het weefsel in BSA-Tube 3 meerdere malen met behulp van een fijne tip Pasteur pipet. Na trituration, breng alle oplossing en weefsel van buizen 2 en 3 in BSA-buis 1 over. Fijnstampen een verdere 2-3 keer en centrifugeer bij 3.000 x g 3 min. Tijdens de centrifuge, make-up complete neurale basale een media (NBA Media). Hoeveelheid 48,5 mL van de NBA-media naar een 50 mL kegelvormige buis en Incubeer bij 37 °C in een waterbad. Label deze Tube “NBA only”. Bovendien wordt een hoeveelheid van 1 mL B27, een hoeveelheid Glutamax van 0,5 mL en een hoeveelheid pen-ontsteking van 0,5 mL bij kamertemperatuur ontdooid. Na centrifugeren, voorzichtig verwijderen van de bovendrijvende uit de pellets weefsel en opnieuw op te schorten de cellen in 2 mL van de volledige media. Gebruik een P1000 pipet om het weefsel op en neer te fijnstampen 20 keer.Opmerking: Zorg ervoor dat u de cellen niet te krachtig pipet. Als er te veel druk wordt uitgeoefend, kunnen de cellen beschadigd raken. Gebruik een pipet van 1 mL Pasteur om de schorsing van de cel te filteren door middel van een 30 µm cel zeef in een polystyreen monsterbuis.Opmerking: Als de cel schorsing niet onmiddellijk door de cel zeef, kan het nodig zijn om druk op de top van de zeef met een steriele handschoen om de stroom te starten. Deze belangrijke stap voorkomt verstopping van de cel Sorter. Voor het verzamelen van neuronen na het sorteren, voor te bereiden inzameling buizen door pipetten 300 µ L van de volledige media om het vereiste aantal polypropyleen buizen. De cel schorsing is nu klaar om te worden genomen om de cel sorter voor het sorteren. Neem de cel schorsing, extra inzameling buizen en reserveonderdelen volledige media in geval verdunning van het monster is vereist. 3. Cell sorteren van gezuiverd erge of glutamaterge neuronen Opmerking: Om de kans op bacteriële besmetting tijdens het sorteren te minimaliseren spoel het steekproef buizenstelsel van de sorter met 70% ethylalcohol minstens 5 min voorafgaand aan het sorteren af. Gedetailleerde sortering parameters variëren tussen instrumenten, fundamentele overwegingen zijn als volgt. Tijdens de eerste cel sorteren, vast te stellen niveaus van achtergrond fluorescentie van ongelabelde cellen door het sorteren en vergelijken van cellen uit een wild type dier. Voor elk type fluorescerende cel dat moet worden gesorteerd, kiest u de juiste excitatie-en emissie filters. Excite Venus en TdTomato eiwitten met behulp van 488 nm of 531 nm excitatie golflengten, respectievelijk. Detecteren uitgezonden licht door middel van 530/40 en 575/30 emissie filter sets, respectievelijk. Voeg polypropyleen inzamelings buizen toe, die 300 l van volledige media bevatten, aan de cel sorter voor de inzameling van de cel. Voor hoge zuiverheid, sorteren fel gelabeld fluorescerende cellen (Zie Figuur 1b bijvoorbeeld dot percelen van gesorteerde cellen). Na het sorteren, voor optimaal resultaat, voer een zuiverheidstest van de gesorteerde cellen uit om zuiverheidsniveaus te schatten. Merk op dat de typische Recovery rate van cellen na het sorteren is tussen de 70 tot 80%. Noteer het aantal cellen gesorteerd in elke collectie buis. Deze waarde wordt gegeven door het sorteer instrument voor cellen.Opmerking: Cel Sorteren kan worden uitgevoerd met behulp van een 70 µm nozzle (70 psi schede vloeistofdruk) of een 100 µm nozzle (20 psi schede vloeistofdruk). 4. kweken van gesorteerde neuronen Na het sorteren van cellen, de overdracht verzamelde cellen tot 2 mL ronde bodem centrifuge buizen, met behulp van een 1 mL Pasteur pipet. Centrifugeer de cellen bij 3.000 x g voor 3 min om een cel korrel te vormen.Opmerking: Om te helpen bij het identificeren van de locatie van de cel pellet, oriënteren de ronde bodem centrifuge buizen met het scharnier van het deksel naar buiten gericht, waardoor de cel pellet te vormen op de achterkant van de centrifugebuis (dat wil zeggen, aan dezelfde kant van de buis als het scharnier). Bij centrifugeren, voeg 1 mL B27, 0,5 mL Glutamax en 0,5 mL pen-keelontsteking toe aan de 48,5 mL van voorverwarmde NBA-media. Schud de oplossing goed, dan filter steriliseren en label als “NBA complete media” (met datum en initialen). Terug naar het waterbad tot de vereiste. Gebruik na centrifugeren een pipet van 1 mL Pasteur om de bovendrijvende over te brengen naar een andere centrifugebuis (Bewaar de bovendrijvende Incase de cel pellet was verstoord). Re-schorsen van de cel pellet in de vereiste hoeveelheid van de voorverwarmde volledige NBA-media om een cel dichtheid van 1.000 cellen te bereiken/µ L. re-Suspend de cellen door te pipetteren op en neer met een P200 of P1000 pipet. Ter bevestiging van de aanwezigheid van gescheiden cellen, controleer dan de cel oplossing onder een Microscoop, met behulp van een 4x of 10x objectieve lens. Alternatief, Pipetteer een kleine hoeveelheid cel oplossing op een dekglaasje en controleer onder de Microscoop. Als er grote aantallen cellen aanwezig zijn, kan de bovendrijvende van stap 4,3 worden genegeerd. Voor het plating van de cellen, Vortex op een gemiddelde snelheid voor 2 – 3 s om een gelijkmatige cel schorsing te garanderen. Na het vortexen, snel Pipetteer 10 µ L van de cel opschorting aan het centrum van elke dekglaasje. Na het pipetteren van de cellen, snel terug elke plaat naar de incubator (5% CO2/37 ° c) en incuberen voor 1 uur.Opmerking: Als het toevoegen van cellen aan veelvoudige 24-goed platen, verzekert zelfs dichtheid van de cel door cellen tussen platen te vortexen. Na 1 h, voeden de cellen met 500 µ L van voorverwarmde volledige NBA media en terug te keren naar de incubator.Opmerking: Bij het voeden van de cellen, is het belangrijk om de media pipet voorzichtig langs de zijkant van de put te vermijden cel loslating. Voor korte experimenten (< 16 dagen), is het voeden bij de bovengenoemde dichtheid niet noodzakelijk. Bij het plating van een grotere dichtheid van cellen, meer frequente voeding intervallen kan worden verlangd (Zie discussie). 5. Astrocyte verrijkte glial support cultures Opmerking: De productie van glial cultures14 en het gebruik van cel cultuur inserts is eerder beschreven12. In het kort, astrocyte verrijkte glia culturen zijn afgeleid van cortico-hippocampale weefsel (met meninges verwijderd; P2 – P5), die zijn gekweekt voor een week op een 20 µ g/mL PLL-gecoate 6-goed platen, in serum aangevuld DMEM media. Om co-cultuur gezuiverde neuronen en glial cellen, passage Confluent glial cellen om het vereiste aantal van de cel cultuur inserts (0,4 µm poriegrootte-Zie tabel van materialen). Om passage de cellen, verwijder een 6-well plaat met Confluent glial cellen uit de incubator en wassen 2 putten, 2 keer, met 2 mL van de voorverwarmde (37 ° c) fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Aspireren de PBS-oplossing en gebruik een P1000 pipet om 1 mL van voorverwarmd (37 °C) trypsine (1:250)/EDTA (0,25%/0.02%) toe te voegen oplossing voor elk goed. Terug de 6-well plaat naar de incubator en controleer elke 2 – 3 min voor de cel loslating. Zodra significante cel detachement heeft voorgedaan, Pipetteer de cellen en de cel oplossing zachtjes op en neer gebruikend een fijne uiteinde Pasteur Pipet, om verder detachement en scheiding van individuele cellen te helpen. Breng de cel oplossing over naar een 15 mL kegel buis en centrifugeer bij 3.000 x g voor 3 min. Re-Suspend de cellen met behulp van een P1000 pipet in 5 mL van de voorverwarmde (37 ° c) NBA complete media door zachtjes te pipetteren op en neer totdat de cel pellet is in oplossing. Voer een aantal cellen uit met een haemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.Opmerking: Na 7 dagen in cultuur, ongeveer 750000-1000000 cellen kunnen worden geoogst van elk goed van een 6-well plaat. Plaat 40.000 glial cellen aan elke cel cultuur invoegen in een 500 µ L druppel (80 cellen/µ L). Na het toestaan van de cellen te houden voor 1 uur, gebruik steriele tang om glial-covered Cell cultuur inserts Transfer naar 24-goed platen met gezuiverde neuronen. Verwijder overtollige media van het oppervlak van de cel cultuur inserts (ongeveer 300 µ L).Opmerking: Zoals luchtbellen kunnen vaak opgesloten onder de cel cultuur inserts, kan het nodig zijn om voorzichtig Kantel de inserts om deze bubbels te verjagen. Als er meer glial cellen worden toegevoegd aan de cel cultuur invoegen, verdere wassen en centrifuge stappen kan nodig zijn om overtollige trypsine te verwijderen, die schadelijk kunnen zijn voor cel overleven.

Representative Results

De dissociatie en de cel sortering van fluorescente neuronen van transgene muis of rat cortico-hippocampale weefsel kan worden uitgevoerd in ongeveer 3 tot 4 h. Het resultaat is een populatie van zeer zuivere fluorescerende neuronen, die kan worden geteeld in cultuur voor 16 dagen. Voor het genereren van gezuiverde culturen werden transgene dieren voor het eerst geïdentificeerd met behulp van een fluorescentielamp met geschikte filter sets (voorbeelden van fluorescerende neonatale VGAT Venus en NexCre; Ai9 muis pups zijn te zien in Figuur 1a). Na de identificatie van transgene dieren, werd het ontleed weefsel gescheiden, en de sterkst fluorescente neuronen werden gesorteerd om een gezuiverde cel bevolking te veroorzaken. Voorbeeld fluorescentie intensiteit dot percelen voor NexCre; Ai9 en VGAT Venus muis neuronen, verkregen tijdens FACS, zijn weergegeven in Figuur 1b. Wanneer geoptimaliseerd, is het mogelijk om tussen 500.000 en 800.000 cellen van de schors en het zeepaardje van individuele P0-2 NexCre te oogsten; Ai9 of VGAT Venus muizen. Cellen kunnen worden gesorteerd op een snelheid omhoog van 600 evenementen/s. schattingen van de zuiverheid van de cellen werden uitgevoerd met behulp van DAPI als een nucleaire marker (figuur 1c). Door sterk positieve cellen te sorteren, kan een zuiverheid van meer dan 97% routinematig worden bereikt7. Na succesvolle sortering moeten geplateerde neuronen rond in vorm verschijnen, een glad membraan hebben en moeten worden gezien om neurites na ongeveer 1 h in vitro te ontkiemen (Figuur 2a, B). Met 7 dagen in vitro, hoewel sommige celdood kan duidelijk zijn, levensvatbare cellen moeten aanwezig zijn in alle cultuuromstandigheden (figuur 2c, D). Op 12 – 16 dagen in vitro, met behulp van hele-cel patch-klem opnames en biocytin15, is het mogelijk om de morfologische en elektrofysiologische ontwikkeling van gezuiverde neuronen (Figuur 3) te onderzoeken. Analyse van gezuiverde culturen blijkt dat zowel glutamaterge en erge neuronen in staat waren om axonen en dendrites uit te breiden van hun cel organen (Figuur 3a, B) en behouden de mogelijkheid om actiepotentialen te genereren in reactie op suprathreshold depolariseren huidige injecties (figuur 3c, D). In het bijzonder, echter, na zuivering, slechts erge neuronen ontvangen significante hoeveelheden van spontane synaptische transmissie, en glutamaterge neuronen ontvangen zeer weinig synaptische transmissie in de afwezigheid van glial cellen (figuur 3e , F) 7. Zoals we eerder hebben gemeld, cellen in gezuiverde culturen hebben de neiging om meer slecht te overleven dan die in ongesorteerde culturen en hebben significant kleinere dendrites en axonen7. Om deze tekorten te overwinnen, hebben wij methodes aangepast en toegepast om de ontwikkeling van gezuiverde culturen met glial cellen12,14te steunen. De cellulaire samenstelling van onze glial support Cultures (DIV7) is te zien in figuur 4a. Deze culturen bevatten hoofdzakelijk glial vezelachtig zure proteïne (GFAP) positieve astrocyten, maar ook bevatte één of andere cluster van de molecule van de differentiatie (CD11b) positieve Microglia en myeline basisproteïne (MBP) positieve oligodendrocyten. Na DIV 7, kunnen deze cellen worden doorberekend aan de cel cultuur inserts te bieden non-contact ondersteuning van gezuiverde neuronen (figuur 4b, C). Analyse van glia-neuron co-culturen blijkt dat ongeveer 40.000 glial cellen voldoende waren om de overleving op lange termijn en de groei van zowel gezuiverd glutamaterge en erge neuronen (figuur 4D, E)7te verbeteren. Bovendien, elektrofysiologische analyse blijkt dat glutamaterge neuronen, co-cultuur met glial cellen, waren zeer actief en had sterk toegenomen netwerkactiviteit (percentage van glial ondersteund glutamaterge neuronen vuren uitbarstingen van actie potentieel: 62%; n = 28; Figuur 4F , G). Glial ondersteuning is daarom belangrijk, niet alleen voor het bevorderen van neuron groei en overleving, maar ook voor het bevorderen van synaptische transmissie en de oprichting van netwerkactiviteit in glutamaterge culturen. Figuur 1: zuivering van glutamaterge en erge neuronen. Abeelden met fluorescerend signaal van de transgene expressie van TdTomato in NexCre; Ai9 muizen (boven) en Venus in VGAT Venus muizen (onder). Schaal staven = 5 mm. (B) de verstrooiings percelen van de intensiteit van de TdTomato en Venus fluorescentie van cortico-hippocampale gescheiden cellen van NexCre; Ai9 muizen (boven) en VGAT Venus muizen (onder). Sterk fluorescente TdTomato of de Venus neuronen werden geselecteerd voor het sorteren (die door de gating dozen wordt vermeld). (C, links) Confocale beelden van gesorteerde TdTomato (boven) en Venus (bottom) positieve neuronen. (C, rechts) Samengevoegd beeld met cellen co-gekleurd met DAPI (in blauwe pseudocolour). TdTomato fluorescentie is endogene en blijft sterk ondanks fixatie (in magenta PSEUDOCOLOR). De Venus uitdrukking wordt verbeterd gebruikend een combinatie van een primair antilichaam dat tegen GFP en Alexa Fluor-488-geconjugeerd secundair antilichaam (in groene PSEUDOCOLOR) wordt geleid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: de cultuur van de cel van gezuiverd glutamaterge of erge neuronen. (A) gecombineerde infrarood (helder gebied) beelden en bovenop fluorescerende signaal van TdTomato (links) en Venus (rechts) positieve neuronen gekweekt voor 1 h in vitro. Witte pijlen geven de locatie van de groeiende neurites. (B) confocale beelden van TdTomato (links) en Venus (rechts) positieve neuronen gekweekt voor 1 h in vitro. (C, D) Helderveld (boven) en gecombineerd helderveld en fluorescerende beelden (onder) van TdTomato (C) en Venus positieve neuronen (D) gekweekt voor 7 dagen in vitro (DIV). De witte pijlen tonen de plaats van gecondenseerde kernen van dode cellen. Gekleurde pijlen identificeren fluorescerend gelabelde neuronen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: morfologische, elektrofysiologische en synaptische eigenschappen van gezuiverde neuronen. (a, B) Confocale beelden van TdTomato (A) en Venus positieve neuronen (B) bij DIV 13 en DIV 14, respectievelijk. De cellen worden voorgesteld in zwarte gebruikend een omgekeerde blik-omhooggaande lijst om neuriet visualisatie te helpen. Openingen tonen het fluorescerende signaal, uitgedrukt door de geïdentificeerde neuronen. (C, D) De spanning reactie van een TdTomato (C) en Venus positief neuron (D) om hyperpolarizing (200 tot-20 pA, in 20 pA stappen) en depolariseren (200 pA) huidige pulsen, verkregen door Whole-Cell patch-klem opnames. Openingen tonen de overeenkomstige opgenomen neuronen. De rest membraanpotentiaal van elke cel is aangegeven aan de linkerkant van de opname te traceren. (E, F) Representatieve spanning-klem opnames (10 s) verkregen uit TdTomato (E) en Venus positieve neuronen (F). Spontane prikkelende postsynaptic evenementen (EPSCs) werden opgenomen van TdTomato positieve neuronen, gehandhaafd op een holding potentieel van 50 mV. Spontaan voorkomende remmende postsynaptic gebeurtenissen (IPSCs) werden opgenomen van Venus positieve neuronen gehandhaafd op een holding potentieel van 0 mV. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: ondersteuning van neuron ontwikkeling met glial co-Culture. (A) confocale beelden van glial culturen immunolabeled voor glial vezelachtig zuur eiwit (GFAP, links), cluster van differentiatie molecuul (CD11b, midden) en myeline basis-eiwit (MBP, rechts). Glial cellen werden gekweekt voor DIV 7. (B) beelden van de cel cultuur inserts gebruikt om co-cultuur glial cellen met gezuiverde neuronen in een non-contact regeling. Ceen schema van de ruimtelijke regeling die wordt gebruikt voor de co-cultuur neuronen en glia. (D, E) Confocale beelden van TdTomato (D) en Venus positieve neuronen (E), gekweekt voor 14 dagen, in de afwezigheid (links) of aanwezigheid (rechts) van glial ondersteuning. (F, G) Stroom-klem opnames (60 s) uit TdTomato (F) en Venus positieve neuronen (G) gekweekt voor 14 dagen in de afwezigheid (boven) of aanwezigheid (bodem) van glial ondersteuning. Neuronen werden opgenomen op hun rust membraanpotentiaal (gepresenteerd aan de linkerkant van elke opname te traceren). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

We beschrijven hier een methode die de sortering en kweken van primaire neuronen combineert met het genereren van gezuiverde neuronale cellen culturen. Deze methode duurt ongeveer 1 uur langer dan een typische primaire gescheiden neuronale cultuur protocol nog staat voor de generatie van honderden repliceren culturen met specifieke neuronale types. Gezuiverde neuronen, die kunnen worden geteeld in isolement voor ten minste 16 dagen, uit te breiden axonen en dendrites en kan repetitieve treinen van actiepotentialen (Figuur 2 es Figuur 3). Belangrijk is, deze cellen zijn vatbaar voor dezelfde experimentele analyses als reguliere primaire gescheiden neuronale culturen, met inbegrip van elektrofysiologische, morfologische en overlevings analyses. Een groot voordeel van het werken met deze gezuiverde culturen is dat de ontwikkeling van specifieke soorten cellen kan worden bestudeerd in isolement. Ter ondersteuning van de ontwikkeling van gezuiverde culturen, presenteren we ook een protocol voor co-kweken gezuiverde neuronen met glial cellen. Zoals eerder getoond, co-kweken gezuiverde neuronen met glial cellen verbetert hun overleving, groei en kan bevorderen netwerkvorming7 (Figuur 4). Zo presenteren we hier een combinatie van methoden die moeten verder de studie van glia-neuron interacties en kan nuttig zijn voor het bestuderen van de ontwikkeling en interactie tussen andere soorten van de cel van belang.

Studies over culturen van gezuiverde glutamaterge neuronen hebben onthuld fundamentele inzichten in de manier waarop glial cellen afscheiden factoren die de ontwikkeling van neuronale netwerken en SYNAPS vorming te bevorderen16,17,18 . In het algemeen, methoden voor het zuiveren van specifieke neuron types zijn meer met succes toegepast op het bestuderen van de ontwikkeling van glutamaterge neuronen in plaats van erge neuronen. Dit heeft geleid tot een ongelijkheid in ons begrip van hoe deze twee soorten cellen te ontwikkelen. Gezien het erge en glutamaterge neuronen aanzienlijk verschillen in termen van hun anatomie, fysiologie en ontwikkelingsstoornissen oorsprong, is het van vitaal belang dat we erge neuronen in hun eigen recht te bestuderen, om beter te begrijpen hun functie en fysiologie. Met behulp van het protocol hier gepresenteerd, hebben we eerder geïdentificeerd belangrijke verschillen in de manier waarop erge en glutamaterge neuronen afhangen van glia-afgescheiden factoren voor de oprichting van synaptische transmissie7. Door dit protocol te publiceren hopen we dat anderen verdere inzichten kunnen maken in de belangrijke interacties tussen neuronen en glial cellen.

In dit protocol beschrijven we een flow Cytometry gebaseerde cel sorteermethode, die we hebben gebruikt om te zuiveren erge of glutamaterge neuronen uit verschillende transgene knaagdieren lijnen. Venus positieve erge neuronen werden gesorteerd van VGAT Venus muizen13 of ratten8 en TdTomato positieve glutamaterge neuronen werden gesorteerd vanaf NexCre; Ai9 muizen (oorspronkelijk gefokt uit NexCre9 en Ai9 reporter Lines6, zie Turko et al., 20187). In de afgelopen jaren, als gevolg van technologische ontwikkelingen, is de generatie van transgene dieren aanzienlijk gemakkelijker geworden. Als dusdanig, is de beschikbaarheid van dieren die fluorescente molecules uitdrukken, in vele verschillende cel types, snel gegroeid. Dit heeft op zijn beurt, verhoogde het gebruik en de toepasbaarheid van fluorescerende geactiveerde cel sorteren. Terwijl de alternatieve methodes voor het isoleren van belangrijke cellen momenteel16,19,20bestaan, worden zij enigszins belemmerd door hun afhankelijkheid van de beschikbaarheid van geschikte antilichamen aan natuurlijk-het voorkomen oppervlakte Antigenen. Dit beperkt hun veelzijdigheid in vergelijking met fluorescentie-gebaseerde cel sorteermethoden, die al kan worden gebruikt om cellen te sorteren van de vele cel specifieke transgene reporter dieren die al beschikbaar zijn. Niettemin, wanneer geoptimaliseerde, antilichaam-gebaseerde sorteermethoden kan worden snelle en hoge opbrengst, en kan zelfs beter te behouden cel anatomie, door het toestaan van zuivering van cellen met hun axonen en dendrites intact21. Het sorteren van antilichamen moet daarom nog worden overwogen bij de besluitvorming over een sorteer strategie. Uiteindelijk is het soort cel van belang, de leeftijd waarop cellen moeten worden gesorteerd, de beschikbaarheid van transgene dieren of oppervlakte-antigenen en het aantal benodigde cellen zal de bepalende factoren bij het kiezen van de meest geschikte Sorteer-strategie.

Hoewel op fluorescentie gebaseerde cellen sorteren een eenvoudige en reproduceerbare methode is voor het zuiveren van cellen, moet tijdens bepaalde stappen van het protocol zorg worden besteed aan het behoud van de cel kwaliteit. Bijvoorbeeld, na elke centrifugale stap, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de cel pellet wordt opnieuw opgeschort zo snel mogelijk en dat de cellen met succes zijn hersteld. Af en toe, de cel pellet kan worden verstoord bij het verwijderen van de bovendrijvende. Het is daarom geadviseerd, tussen Centrifugeer stappen, om de aanwezigheid van cellen onder de Microscoop te controleren om om het even welk uitgebreid cel verlies uit te sluiten. Na cel plating, moeten de cellen worden toegestaan om zich te houden voor ten minste 1 uur voor het voederen. Als de cellen te spoedig worden gevoed, kunnen sommige cellen van dekglaasje worden verdreven, daardoor verminderend de cultuur dichtheid. Na 1 uur in cultuur, is het verstandig om de gezondheid van de cel te beoordelen. Als de cellen niet gezond lijken (een voorbeeld van gezonde cellen wordt weergegeven in Figuur 2a), of er is significante celdood, dan kan dit een indicatie van een probleem tijdens de dissociatie of Sorteer procedure. Een verdere belangrijke overweging, wanneer kweken elk type cel, is om zorg te dragen bij het beheer van de cel cultuurmedia. NBA Media bevat fenol rood, die fungeert als een pH-indicator22. Als de media wordt te geel van kleur, dan is dit geeft aan dat de pH is te zuur; Als de media wordt te roze, dan is dit geeft aan dat de oplossing is te alkalisch. Stock oplossingen open voor lange periodes, met name media gepaard in kegelvormige buizen, de neiging om meer alkalisch geworden in de tijd. Het is daarom geadviseerd om make-up verse volledige NBA media elke week en complete media om de twee weken (de medium buffers onder atmosferische omstandigheden en moet daarom stabieler). Rekening houdend met deze punten in aanmerking moet het mogelijk zijn om gezuiverde cel culturen vast te stellen in elk laboratorium met toegang tot cel Sorteren en cel cultuur apparatuur.

In het merendeel van onze experimenten produceerden we gezuiverde culturen uit een enkel dier. Echter, bij het zuiveren van cellen voor biochemische analyses, kan het nodig zijn om samen te bundelen meerdere dieren voor het sorteren. We hebben met succes gesorteerd tot 8 embryonale muizen (embryonale dag 13 dieren) met behulp van het bovenstaande Protocol (gegevens niet getoond). Echter, als er meer dieren worden gesorteerd, kan het nodig zijn om het volume van zowel papaïne en BSA oplossingen (beschreven in stappen 2.1.1-2.1.4) te verhogen om de toename van het weefsel bedrag tegemoet te komen. Bovendien, als er meer cellen worden geplateerd in de cultuur, dan is een meer frequente voeding schema kan worden verlangd. Als uitgangspunt, cellen kunnen worden gevoed om de 7 dagen door het verwijderen van 100 µ L van geconditioneerde media en het toevoegen van 200 µ L van verse volledige NBA media. Omwille van het neuron levensvatbaarheid, als het sorteren van meer dieren, dacht moet worden gegeven aan het minimaliseren van de soort tijd zoveel mogelijk. Dit vereist vaak de zorgvuldige optimalisering van stroomafwaartse analyses voor het efficiënte gebruik van gezuiverde cellen. We hebben routinematig gesorteerd muis neuronen aan de tarieven van 600 evenementen/s, tot 500000-800000 cellen per dier (postnatale dag 0 – 2). Dit was echter zonder uitputtende optimalisering van sorteer snelheden en voorwaarden. Daarom moeten verdere verbeteringen in sorteersnelheid en rendement mogelijk zijn.

Gezuiverde neuronen vereisen glia-geconditioneerde media voor hun overleving. Dit is eerder aangetoond door kweken neuronen en glial cellen afzonderlijk, voor de behandeling van neuronen met glial geconditioneerde media10. In onze experimenten, kozen we voor de ondersteuning van gezuiverde neuronen door kweken glial cellen op semi-doorlaatbaar cel cultuur inserts, die worden geplaatst in de cel cultuur plaat. Deze methode is met succes toegepast om te studeren glia-afgeleide extracellulaire matrix eiwitten en hun interactie met neuronen12. De niet-contact, maar continue ondersteuning die door deze methode heeft een aantal voordelen in vergelijking met de aparte cultuur van cellen. Het meest in het bijzonder, de co-cultuur van glial cellen met neuronen zorgt voor de voortdurende regulering en conditionering van de cel cultuurmedia, die meer lijkt op de in vivo situatie. Bovendien zorgt de ononderbroken co-cultuur van cellen voor het potentiële terugkoppelen signaleren tussen neuronen en glia, die niet mogelijk in gescheiden culturen is. In ons protocol, indien nodig, de continue co-cultuurmethode kan gemakkelijk worden weggelaten en een klassieke behandeling van neuronen met glia-geconditioneerde media kan worden uitgevoerd.

Samengevat, het protocol hier gepresenteerd is bedoeld om de lezer te voorzien van een solide basis van waaruit zij kunnen hun eigen gezuiverde cel cultuur experimenten vast te stellen. We voorspellen dat de beschikbaarheid van transgene dieren en virale constructies zal blijven stijgen voor de nabije toekomst. Daarom, cel Sorteren technieken op basis van fluorescentie zijn waarschijnlijk nog meer op grote schaal gebruikt en waardevol.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen bedanken de uitstekende technische ondersteuning die door Jenny Kirsch en Ana Teichmüller-op de flow Cytometry core Facility, Deutsches reuma-Forschungszentrum, Berlijn. We willen graag Jie Song bedanken voor zijn hulp bij survival analysis. We willen ook Rita Loureiro bedanken voor haar hulp bij het vastleggen van de beelden van fluorescente muizen en Christian Ebner voor het kritisch lezen van het protocol. VGAT-Venus transgene ratten werden opgewekt door drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi en Y. Kawaguchi in nationaal instituut voor fysiologische wetenschappen, Okazaki, Japan, gebruikend pCS2-Venus die door Dr. A. Miyawaki wordt verstrekt. Dit werk werd gesteund door de Duitse Raad voor onderzoek (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 tot IV).

Materials

Neural Basal A media (NBA) ThermoFisher Scientific 10888022 Cell Culture Buffer
B27 ThermoFisher Scientific 17504001 Culture supplement
Glutamax ThermoFisher Scientific 35050-038 Culture supplement
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140-122 Antibiotic
Poly-L-Lysine SIGMA P1399 Coverslip coating
Papain SIGMA P4762-1G Enzyme
Bovine Serum Albumin SIGMA A3294-100G Serum
Hibernate A low fluorescence media Brain Bits Ltd HALF Cell Transport media
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) Biochrom F0435 Glial Culture Buffer
Fetal Calf Serum (FCS) Biochrom S0115 Serum
Trypsin / EDTA Biochrom L2163 Enzyme
Fine Tip Pasteur Pipette Neo Labs – Used for trituration of cells
24-well plates BD 353047 Culture plate
50 mL Falcon tubes BD 352070 –
15 mL Falcon tubes BD 352096 –
Glass coverslips: 12 mm round Roth P231.1 –
35 mm Petri dish Corning 353001 –
100 mm Petri dish Corning 353003 –
30 µm CellTrics Cell Sieve sysmex 04-004-2326 To remove cell clumps before cell sorting
Round bottom polystyrene tubes BD 352054 Transport tube for sorted cells
Round bottom polypropylyne tubes BD 352063 Collection tube for sorted cells
Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET Falcon 353 095 For the co-culture of neurons and glia
Extra fine Bonn Scissors Fine Scientific Tools 14084-08 To remove overlying skin and bone of mice
Extra narrow Scissors Fine Scientific Tools 14088-10 To remove overlying skin and bone of rats
Forceps Fine Scientific Tools 11242-40 To hold the head in place
Spatula (130 mm long / 5 mm tip width) Fine Scientific Tools 3006.1 To remove the brain to filter paper
Scalpel Blades Swan-Morton #0308 To mechanically dissociate neural tissue
Haemocytometer (Neubauer Imroved) Optik Labor – To cell count dissociated cells
Fluorescent Miners Goggles (excitation light) Biological Laboratory Equipment
Maintenance and Servce Ltd (BLS)		 FHS/LS-1G To excite TdTomato
Fluorescent Miners Goggles (emission filter) Biological Laboratory Equipment
Maintenance and Servce Ltd (BLS)		 FHS/EF-4R2 Td Tomato compatible emission filter
Fluorescent Miners Goggles (excitation light) Biological Laboratory Equipment
Maintenance and Servce Ltd (BLS)		 FS/ULS-02B2 To excite Venus
Fluorescent Miners Goggles (emission filter) Biological Laboratory Equipment
Maintenance and Servce Ltd (BLS)		 FS/TEF-3GY1 Venus compatible emission filter
Mouse-Anti-GFP primary antibodies UC Davis 75-132 To enhance Venus signal following fixation
Mouse-Anti-GFAP primary antibodies SIGMA G-3893 The identification of reactive astrocytes
Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies Southern Biotech 1561-15 The identification of microglial cells
Rabbit-Anti-MBP primary antibodies Millipore AB980 The identification of oligodendrocyes
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 91, 1-24 (1998).
  2. Feher, K., Kirsch, J., Radbruch, A., Chang, H. D., Kaiser, T. Cell population identification using fluorescence-minus-one controls with a one-class classifying algorithm. Bioinformatics. 30 (23), 3372-3378 (2014).
  3. Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
  4. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
  5. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
  6. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  7. Turko, P., Groberman, K., Browa, F., Cobb, S., Vida, I. Differential Dependence of GABAergic and Glutamatergic Neurons on Glia for the Establishment of Synaptic Transmission. Cerebral Cortex. , (2018).
  8. Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical gabaergic neurons revealed in transgenic venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
  9. Goebbels, S., Bormuth, I., Bode, U., Hermanson, O., Schwab, M. H., Nave, K. -. A. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44, 611-621 (2006).
  10. Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209, 809-810 (1980).
  11. Lindsay, R. M. Adult rat brain astrocytes support survival of both NGF-dependent and NGF-insensitive neurones. Nature. 282 (5734), 80-82 (1979).
  12. Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7742-7755 (2013).
  13. Wang, Y., et al. Fluorescent labeling of both gabaergicand glycinergic neurons in vesicular GABA transporter (VGAT)-venus transgenic mouse. Neurociencias. 164 (3), 1031-1043 (2009).
  14. Höltje, M., et al. Role of Rho gtpasein astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing. Journal of Neurochemistry. 95 (5), 1237-1248 (2005).
  15. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. Journal of Visualized Experiments. , e51706 (2014).
  16. Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277 (5332), 1684-1687 (1997).
  17. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
  18. Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
  19. Berghuis, P., et al. Brain-derived neurotrophic factor controls functional differentiation and microcircuit formation of selectively isolated fast-spiking gabaergic interneurons. European Journal of Neuroscience. 20 (5), 1290-1306 (2004).
  20. Liddelow, S. A., et al. Activated microglia induce neurotoxic reactive astrocytes via Il-1α, tnfα, and c1q. Nature. 541, 481-487 (2017).
  21. Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
  22. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).

Tags

Primary Cell CultureGABAergic NeuronsGlutamatergic NeuronsFluorescence-activated Cell SortingNeuronal PhysiologySynapsesNeuronal NetworksPLL CoatingCell Culture BufferBSAPapainFilter Sterilization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Turko, P., Groberman, K., Kaiser, T., Yanagawa, Y., Vida, I. Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (148), e58974, doi:10.3791/58974 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image