提高墨西哥龙舌兰对幼虫后表型和全体免疫组织化学的分析

本协议中描述的程序已得到哈佛医学院动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。 1. 育种 注 : 有几种已发布的育种方法 15,16,17, 20也可以在此步骤中使用。在繁殖之前, 成年鱼保持在 10:14 光: 黑暗周期在 23°c, 并喂养颗粒饮食 (见材料表)每天一次。鱼可以在循环系统中进行机械过滤和紫外线灭菌。育种也可以在静态 (非循环) 储罐中完成, 但鱼不应该留在静态水箱超过 3天, 因为水质迅速退化。 用鱼准备好的水填充5加仑的水箱 (调整为: ph = 7.1 +/-2, 电导率 = 900 +/15μs, 温度 = 23°c)。 将塑料网 (见材料) 放置在罐的底部。如果在静态储罐中繁殖, 则将热水器贴在水箱的一侧。如果在循环系统中繁殖, 则在系统水池中放置热水器。注: 塑料网可防止成人食用鸡蛋。 将一条1岁以上的雌性和两种雄性a. mexicanus鱼放入鱼缸。让鱼适应30分钟。 将加热器的温度设置为 24°c (或比起始温度高 1°c)。 24小时后, 将温度提高1°c。 24小时后, 将温度提高1°c。每天用手电筒照射油箱底部, 检查储罐中是否有鸡蛋。在这3天期间, 不要吃鱼。 如果3天后仍未诱导产卵, 请关闭加热器, 让水恢复到室温 (rt), 然后将鱼转移到原来的鱼缸。 2. 孵化加肥鸡蛋 一旦在繁育罐中发现鸡蛋, 就取出成虫和塑料网, 用烧杯或杯子将水减少到 1 0 厘米深。注: 要估计产卵时间, 请使用转移式移液器将几个鸡蛋放入培养皿中, 并使用立体显微镜查看它们, 以确定第14阶段并估计受精时间。 将储罐移动到方便的工作表面, 取出任何不透明的鸡蛋或粪便, 只在储罐中留下半透明、肥沃的鸡蛋。注: 此时可以记录可育卵的数量。 在水箱中灌满鱼准备水 (见步骤 1.1), 并在水箱中加入6-7 滴亚甲蓝, 当水充满时。注: 亚甲蓝的最终浓度约为 1.5 ppm。 在水箱中添加加热器和水族馆泡泡 (连接到空气泵上, 带有调节器)。 将加热器设置为 24°c, 并调整气流调节器, 以产生温和的气泡流。 在水箱上放置一个盖子, 以帮助保持水温。注: 鸡蛋应在产卵时间的24小时内开始孵化。 3. 将孵化幼虫转移到苗圃容器 在8升鱼类水 (见步骤1.1) 中加入20克盐 (见材料), 搅拌至溶解。将每个 1.5 l 苗圃容器 (见材料) 填充1升的准备水。 使用转移式移液器将孵化的幼虫移动到准备好的苗圃容器中, 每个容器的密度为20条鱼。注: 前大灯可用于定位和转移孵化的幼虫。 在所有可见的孵化幼虫被清除后, 搅拌水箱中的水搅拌, 并/或用移液器将喷水吹入水箱的边缘和角落。注: 这将有助于揭示在第一关错过的幼虫。 在这个阶段, 使用实验室福利办公室的指引处理未使用的幼虫。在罐中加入次氯酸钠, 最终浓度达到6.15。等待至少 5分钟, 然后再倒下水槽。 在每个苗圃容器上标注受精的日期和时间。每天查看苗圃容器, 并继续清除任何死幼虫。 4. 轮铁鱼食的制备 有关获取轮虫的信息, 请参阅材料表。按照参考协议设置、维护和收获轮虫22。 在1升收获的轮虫中加入3毫升藻类混合物 (见材料表), 准备鱼类食品。这种混合物将作为食物供应直接添加到苗圃容器中。 5. 幼体后鱼的喂养 当鱼在受精后 5天 (dpf) 时, 在每个苗圃容器中加入3毫升的鱼食 (步骤4.2 中准备)。在最佳密度下, 轮虫应该在苗圃容器的角落密集的组中可见, 在容器的中心则不那么明显。加入额外的轮状混合物, 直到达到适当的密度。 每天检查容器是否有轮虫, 如果浓度耗尽, 则添加更多。继续清除任何死幼虫。 当鱼到达 14 dpf 时, 将它们移动到一个装有循环系统的水箱中, 密度为5鱼/水。注: 在这个时候可以记录幼虫后存活的鱼的数量。 6. 幼虫后鱼类的全装免疫组织化学 将含有鱼的苗圃容器通过尼龙网过滤器将所需阶段的幼虫后鱼从食物中取出 24小时, 然后将过滤器放入有干净的鱼准备水的容器中 (见步骤 1.1)。注: 必须删除所有的食物。即使是肠道中的少量食物也是自动荧光的, 会影响成像。 收集和安乐死的鱼。注: 安乐死协议应遵循 olaw 指南, 并得到您的机构动物护理和使用委员会的批准。我们注意到, 只有毛滴虫并不对幼虫后的鱼实施安乐死, 如果鱼也不在冰上, 鱼从毛滴虫转移到固定鱼身上就会开始移动。 在烧杯中加入 0.4 g 的三尖碱-s 和 0.8 g 的碳酸氢钠, 加入1升的去离子水, 并将其放置在冰上, 从而制备滴虫溶液。 将含有鱼的水通过尼龙网过滤器中倒出来收集鱼。轻轻将过滤器浸入冰凉的特里卡因溶液中, 放在冰上 1 0分钟。 修复安乐死的鱼。 使用带有切割尖端的转移移液器将鱼转移到锥形管。 用转移移液器取出 tricaine 溶液, 并更换固定液。用摇晃孵化。注: 固定和固定时间必须根据所使用的抗体确定。10% 福尔拉林溶液 (4% 甲醛, 见材料) 在4°c 过夜, 足以满足材料表中列出的抗体。注意: 福尔马林有毒且易燃。佩戴个人防护设备 (手套、实验室外套和飞溅护目镜), 并戴上化学罩。含有福尔拉林的溶液应作为危险废物处置。 使用转移移液器小心地取出固定装置, 而不会干扰鱼。加入3毫升磷酸盐缓冲盐-三元溶液 [pbs 与 0.1% triton (pbst), 见材料] 和孵育15分钟在 rt 与摇摆。 取出 pbst, 更换新鲜 pbst, 孵育 15分钟. 再重复一次 “清洗”。注: 鱼类可在4°c 下在含有0.02% 氮化钠的 pbs 中储存数周。 进行全身性免疫染色。 制备50毫升的阻滞剂 [pb-0.5% triton x, 0.2% 牛血清白蛋白 (bsa), 1% 亚甲基亚硫酸 (dmso), 0.02% 氮化钠, 5% 驴血清]。注意: 氮化钠和 dmso 是有毒的。搬运时应使用个人防护设备 (手套、实验室外套和飞溅护目镜)。任何解决办法都应作为危险废物加以处置。 使用转移移液器将鱼转移到带有螺丝钉顶盖的4毫升玻璃小瓶中。使用传输移液器删除 pbst 并添加 3 ml 阻塞解决方案。在 rt 孵化 1小时, 摇号。 使用转移移液器去除阻塞溶液, 并添加在阻塞溶液中稀释的初级抗体。在室温下搅拌过夜。注: 例如, 添加1:250 稀释抗 huc/hhd 神经蛋白小鼠单克隆抗体 (关于已成功用于a. mexicanus的抗体清单, 请参见材料表)。在此步骤中, 应包括一组不添加初级抗体的鱼类。抗体的体积应该足以覆盖鱼, 并允许搅拌。 如步骤6.3.4 中所述, 用 pbst 清洗鱼3次。用阻断溶液中稀释的二级抗体取代 pbst, 并在 rt 用搅拌孵育一夜。注: 应确定每个抗体的最佳一级和二级抗体浓度、培养时间和培养温度。在 rt 过夜对材料表中列出的抗体有效。 用 pbst 清洗鱼 3次, 每次清洗持续 15分钟, 如步骤6.3.4 中所述。 将鱼转移到 pbs 进行短期储存, 然后再对鱼进行解剖、安装或切片。