Evaluar la integridad del ADN de la célula de vástago para terapia celular cardiaca
Summary
Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una instalación experimental para el análisis de la evaluación de la integridad del ADN en células antes del trasplante de la célula.
Abstract
Vástago y las células derivadas de células madre tienen enorme potencial como terapia regenerativa para diversas enfermedades degenerativas. El ADN es el almacén de la información genética en todas las células, incluyendo células madre, y su integridad es fundamental para su capacidad regenerativa. Las células madre experimentan rápida propagación en los laboratorios para alcanzar el número necesario para el trasplante. Crecimiento acelerado de células conduce a la pérdida de la integridad del ADN por metabolitos acumulados, tales como reactivo oxígeno carbonilo y agentes alquilantes. Transplante de estas células daría lugar a pobres engraftment y regeneración del órgano del deterioro. Por otra parte, el trasplante las células dañadas DNA conduce a mutaciones, inestabilidad del ADN, senescencia celular y posiblemente, mortales enfermedades como el cáncer. Por lo tanto, hay una necesidad inmediata de un método de control de calidad evaluar la idoneidad de la célula para el trasplante. Aquí, le ofrecemos protocolos paso a paso para la evaluación de la integridad del ADN de células antes del trasplante de la célula.
Introduction
Evidencia clínica y experimental demuestra que el trasplante de la célula moderado puede mejorar el rendimiento contráctil del ventrículo izquierdo de no corazones1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Los avances recientes se han abierto más atractivas oportunidades de regeneración cardiovascular; Estos incluyen la expresión forzada de los factores de reprogramación de células somáticas para inducir pluripotencia y distinguir estas células pluripotentes inducidas (iPSC) en diversos linajes cardíacos, lo importante de cardiomiocitos (CM)10, 11 , 12 , 13. el material hereditario en cada célula, incluyendo el iPSCs artificialmente generados y derivados de iPSC CM (iPS-CM), es el ADN. Las instrucciones genéticas almacenadas en el ADN determina el crecimiento, desarrollo y función de las células, tejidos, órganos y organismos. El ADN no es inerte; metabolitos, como el oxígeno reactivo, carbonilo y especies de nitrógeno, la célula y agentes alquilantes puede dañar ADN causa in vitro e in vivo14,15,16,17. Lo importante, daño de la DNA ocurre intuitivamente en cada célula, con una frecuencia significativa. Si no se corrigen estos daños, conducirá a la mutación de la DNA, senescencia celular, la pérdida de integridad de ADN y la célula y posiblemente, enfermedades, entre ellas cánceres mortales. Por lo tanto, conservar la integridad del ADN es esencial para cualquier célula, especialmente iPSCs, que tiene un enorme potencial en la clínica.
Para evaluar la cantidad e integridad del ADN genómico aislado, equipo costoso está disponible en el mercado. Sin embargo, no existen métodos simples y rentables para evaluar la integridad del ADN en las células sin aislar las células. Además, la degradación del ADN inducida por el usuario durante el aislamiento del ADN es uno de los principales inconvenientes en el uso de estos métodos. Las sola célula gel electroforesis (conocido como ensayo cometa)18,19 γH2A.X inmunomarcación8 técnicas y son los enfoques fundamentales en los laboratorios de investigación para la evaluación de daños en el ADN. Estos dos métodos no requieren equipos costosos o ADN genómico aislado para analizar ADN integridad8,20,21. Desde entonces, se han realizado estas técnicas con células enteras; degradación de DNA/RNA/proteína inducida por el usuario durante la preparación de la muestra no afecta a estos protocolos. Para evaluar el daño en el ADN y respuesta del daño de ADN en el tallo y las células derivadas de células madre, presentamos protocolos paso a paso para realizar la inmunomarcación γH2A.X y ensayo de cometa. Por otra parte, la combinación de estos dos enfoques, proponemos una evaluación ingenua que puede utilizarse para evaluar la idoneidad de la célula para el trasplante.
El ensayo cometa, o unicelulares electrophoresis del gel, las medidas de las roturas de ADN en las células. Células encajadas agarosa de bajo punto de fusión son lisis a nucleoids de forma que contengan ADN superenrollado. Sobre electroforesis, pequeños trozos de ADN fragmentado y hebras rotas de ADN migran a través de los poros de agarosa, mientras que el ADN intacto, debido a su enorme tamaño y su conjugación con la proteína de la matriz, tendrá una migración limitada. El patrón de ADN teñido con un microscopio de fluorescencia imita un cometa. La cabeza del cometa contiene ADN intacto y la cola está compuesta de fragmentos y rota filamentos de la DNA. La fracción del daño del ADN puede medirse por la intensidad de la fluorescencia del ADN dañado (cola de cometa) en relación con la intensidad de (cabeza del cometa) ADN intacta. El momento de la cola de parámetro puede calcularse como se muestra en la figura 1.
Daño del ADN induce la fosforilación de la histona H2A. X (γH2A.X) en Ser139 por quinasas ATM, ATR y DNA-PK. La fosforilación y la contratación de H2A. X en roturas del filamento de ADN se llama ADN daños respuesta (DDR) y ocurre rápidamente después de ADN está dañado. Después de este proceso, detención del ciclo celular mediada por el checkpoint y ADN se inician los procesos de reparación. Después de la realización de la reparación del ADN, γH2A.X es defosforilaciones e inactivado por fosfatasas. Prolongada y múltiples roturas del filamento del ADN conducen a la acumulación de focos γH2A.X en el ADN. Esto indica la incapacidad de la célula para reparar el daño en el ADN y la pérdida de integridad de ADN. Pueden identificarse estos focos γH2A.X en el ADN y el número de focos DDR puede contarse utilizando el protocolo en la sección 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Integridad del ADN retrata la integridad celular. Las células con ADN dañado están con frecuencia en tensión y eventualmente pierden su integridad. La integridad de la madre y las células derivadas de células madre que están propagándose con el fin de trasplante es principal para las células realizar su función deseada. Transplante de células con ADN dañado resultaría en una tasa de pobres engraftment y rendimiento de la celda8,20. Por lo tanto, exam…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por el corazón nacional, pulmón y sangre Instituto becas to1-HL-99507, HL-114120 131017 HL, HL138023 y UO1-HL-134764 (a J. Zhang) y por el americano corazón Asociación científica desarrollo Grant 17SDG33670677 (a R. Kannappan).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
Referencias
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
