Bütün genomik DNA analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama

Not: NLR seq Protokolü üç ardışık adımlardan oluşur: 1) çıkarımı yüksek moleküler ağırlık (HMW) genomik DNA; 2) istenilen boyutlarda HMW DNA’ya parçalanma ve ligasyonu sıralaması bağdaştırıcısı için DNA içeren olağanüstü uzun DNA Kütüphane inşaat sona erer; ve 3) bağdaştırıcısı bakmaksızın DNA nanopores (şekil 1) dizileri üzerine yükleme. 1. HMW DNA ekstraksiyon Reaktif Kur. 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) arabellek (1000 mL) x 100 mL PBS ekleyerek yapmak (10 x) 900 ml su ve karışımı iyi. Lizis arabellek (50 mL) 50 mL tüp 43,5 mL su ekleyerek getirin. 500 μL Tris (1 M, pH 8.0), 1 mL Sodyum Klorür (NaCl) (5 M), ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (0, 5 M, pH 8.0) 2.5 mL ekleyin ve 2.5 mL Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) (, wt/vol) tüp ve iyice karıştırın.Not: Bu PBS arabellek 4 ° C’de 6 aya kadar muhafaza edilebilir. Hazır lizis arabellek RT 2 aya kadar saklanabilir. Hücre ölüm kontrol edin ve hücreleri saymak. > canlı orandır ve 30 x 106toplam telefon numarası olduğundan emin olun.Not: Bu protokol için kullanılan hücre HG00733 hücre satırı, Porto Riko kökenli 1000 genom konsorsiyum içinde yapısal değişim analizi için yaygın olarak kullanılan bir insan lymphoblastoid hücre satırı vardır (bkz. tablo sipariş bilgileri için malzemelerin) ait olduğu Uluslararası genom örnek kaynak için. 200 x g RT. atma orta, 5 min için de centrifuging tarafından hücreleri toplamak ve hücre Pelet (30 x 106 hücreler) ile 5 mL 1 x PBS arabellek de resuspend. 200 x g RT, 5 min için de yine santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.Not: 25-35 x 106 hücre bu yaklaşım için kabul edilebilir. Daha fazla varyasyon kullanılan hücre miktarı daha fazla en iyi duruma getirme gerekir. Hücre Pelet −80 ° C 6 aya kadar muhafaza edilebilir. Hücre Pelet 1 x PBS arabellek 200 μL içinde resuspend. Donmuş hücre Pelet kullanıyorsanız, 5 mL 1 x PBS arabellek ile yıkayın. Belgili tanımlık eriyik vasıl 200 x g RT, 5 min için santrifüj kapasitesi, süpernatant atın ve 1 PBS arabellek x 200 μL hücrelerde resuspend. 10 mL 50 mL tüp arabellekte lizis hazırlayın. 200 μL hücre süspansiyon lizis tampon ve girdap en yüksek hızda 3 s. Incubate için 1 h 37 ° C’de çözüm için ekleyin. 2 μL (100 mg/mL) RNase A, lysate için ekleyin. Örnek karıştırmak için 50 mL tüp Yavaşça döndürün. Çözüm için 1 h 37 ° C’de kuluçkaya. 50 μL İndinavir K (20 mg/mL) lysate için ekleyin. Örnek karıştırmak için 50 mL tüp Yavaşça döndürün. 50 ° c 2 h için çözüm kuluçkaya. Kuluçka sırasında her 30 dakikada örnek karışımı yavaşça. 50 ° C’den 50 mL tüp kaldırmak ve RT 5 min için bekletin. Fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1, vol/vol/vol) fenol tabakası 10 mL lysate için ekleyin ve bir rotator Mikser tüp döndürmek ( Tablo malzemelerigörmek) RT bir duman başlıklı 10 dakika süreyle 20 RPM, tüp kap kaçağı önlemek için parafilm ile şal döndürme sırasında. İki 50 mL jel tüpler ( Tablo malzemelerigörmek) 1.500 x g RT. 2 min için de centrifuging hazırlamakNot: Jel nükleik asit içeren sulu faz ve organik çözücü arasında istikrarlı bir bariyer oluşturur. Örnek/fenol çözüm hazırlanan 50 mL birine jel tüpler kimden adım 1,10 dökün. 3000 x g 10 dk RT. az için de çözüm santrifüj kapasitesi Süpernatant yeni 50 mL tüp içine dökün. Fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1, vol/vol/vol) fenol tabakası 10 mL ekleyin ve bir rotator Mikser RT, bir duman başlıklı 20 devirde 10 dk metroyla döndürün. İkinci bir kez ile hazırlanan adım 1.11 jel boru tekrarlayın. Süpernatant yeni 50 mL tüp içine dökün. Buz gibi % 100 etanol 25 mL ekleyin ve DNA (Şekil 2) precipitates kadar yavaşça tüp el ile çevirin.Not: Yağış yaklaşım HMW DNA istikrara yardımcı olur. Bir kanca yapmak için 20 μL bahşiş viraj. Dikkatle HMW DNA kanca ile çıkar ve sıvı damla salmak. HMW DNA 40 mL % 70 etanol içeren bir 50 mL tüp içine yerleştirin. DNA yavaşça tüp 3 kez ters çevirme ile yıkayın. %1,15 70 etanol tüp sizden DNA toplamak için bir kez yineleyin. HMW DNA 1,8 mL % 70 etanol içeren bir 2 mL tüp içine yerleştirin. 10.000 x g 3 için de yıkanmış HMW DNA santrifüj kapasitesi RT. Kaldır artık etanol pipetting tarafından mümkün olduğunca daha fazla s.Not: DNA Pelet kalan etanol pipetting zaman rahatsız etmeyin. Örnek kuruması için açık kapaklı 10 dk 37 ° C’de 2 mL tüp kuluçkaya. Sürekli ile 2.1 (mekanik kesme ve 1 D ligasyonu sıralama Kit ile) çıkarsan, 2 mL tüp TE (10 mM Tris ve 1 mM EDTA, pH 8.0) 1 mL ekleyin. 10 mm Tris (pH 8.0) ile %0,02 200 μL (transposase tabanlı parçalanma ve hızlı sıralama seti ile), adım 2.2 ile devam eklerseniz Triton X-100.Not: DNA Pelet rahatsız etmeyin. Karanlıkta 4 ° C’de 48 h için stand tüp izin tam resuspend örnek yardımcı olacaktır. HMW DNA 4 ° C’de 2 haftaya kadar saklanabilir. Daha uzun saklama süresi veya diğer saklama koşulları daha fazla kısa parçaları ile tanıştırayım. 2. olağanüstü uzun DNA Kütüphane İnşaat Not: Nanopore sıralama kitleri ile birleştiğinde iki farklı kesme yöntemlerine bağlı Ultra uzun DNA kitaplıkları oluşturmak için iki yol vardır. Mekanik bir yamultma tabanlı kitaplık Kütüphane yapımı için 8 h hakkında alarak bir N50 50-70 KB, verilerle üretir. Transposase parçalanma tabanlı kitaplık Kütüphane yapımı için sadece 90 dakika alarak bir N50 90-100 kb veri üretir. Mekanik yamultma iletişim kuralı sıralaması bağdaştırıcısı ve kalite nanopore akışı hücre aynı sürümlerini kullanarak giriş aynı DNA’dan daha yüksek verim sağlar. Mekanik yamultma tabanlı kitaplık İnşaat Tezcan ve tüp ligasyonu üzerinden reaktifleri ( Tablo malzemelerigörmek) kit karışımı. Tezcan FFPE DNA onarım arabellek ve son onarım/dA-takip arabellek buz, sonra girdap ve mix aşağı spin. Bağdaştırıcı mix (AMX) ve buz, sonra pipet ve spin bağdaştırıcısı boncuk bağlama arabellek (ABB) karıştırmak için aşağı çözülme. Tezcan aşağı çalışan yakıt karışımını (RBF) ile tampon ve RT, sonra girdap ve spin, elüsyon tampon (ELB) karıştırmak için. RT ve pipet kullanmadan önce karıştırmak için boncuk (LLB) yükleme kitaplığı çözülme. Bir kez çözdürülen, tüm kit bileşenleri buz üzerinde tutun. Yalnızca gerektiğinde enzimler al. Manyetik boncuklar RT için kullanılmak üzere getir.Not: kullanmak manyetik boncuklar için öneriler malzemelerin tabloya bakın. Adım 1.21.1 HMW DNA’dan miktarı ve kalitesini kontrol edin. Pipet P200 geniş kullanarak HMW DNA tüp içinde üç farklı konumlardan yeni 1,5 mL tüpler içine DNA’ın 20 μL dışarı ipuçları verdi. Bir yer ve okuma bir UV kullanarak kalitesini kullanarak toplama algılamak için üç aliquots üzerinden 1 μL al. Görüntülenen sonuçları onaylamak için birden çok kez kontrol edin.Not: Beklenen sonuçları şekil 3Aiçinde gösterilir. OD260/280 değeri yaklaşık 1,9 ve OD260/230 değeri yaklaşık 2.3. Transfer HMW DNA kalan 940 μL P1000 geniş bir 50 mL tüp kap içine ucu delik. Tüm DNA 1 mL şırınga iğne olmadan içine Aspire edin. 27 G iğne şırınga koymak ve tüm DNA kap nazikçe ve yavaşça dışarı atmak (~ 10 s). 27 G iğne şırıngadan çıkarın. 2.1.4 2.1.5 30 yolcu olmak üzere toplam 29 kez için iğne aygıtlarından.Not: Yamultulmuş HMW DNA karanlıkta 4 ° C’de 24 h kalite kontrol (QC) en çok darbe alan Jel Elektroforez tarafından önerilir, ama pahalı ve zaman alıcı depolanabilir. QC bir otomatik darbe alan Jel Elektroforez makinede gerçekleştirme, bir 5-150 kb iletişim kuralını çalıştırmak 20 h için kullanmanız. Beklenen sonuçları şekil 4′ te gösterilmiştir. DNA onarım tepki 0.2 mL tüp içinde yamultulmuş HMW DNA’ın 100 μL ekleyerek hazırlamak (20 μg), FFPE DNA onarım arabelleği 15 μL, 12 μL FFPE DNA onarım mix ve 16 μL nükleaz ücretsiz su. Yavaşça 6 kez flicking tarafından tepki mix ve Kaldır kabarcıklar aşağı spin. 60 dk. Transfer için 20 ° C’de tepki örnek P200 geniş geçişli bahşiş ile yeni bir 1,5 mL tüp içine kuluçkaya. Manyetik boncuklar pipetting veya vortexing tarafından resuspend. 143 μL boncuk (1 x) DNA onarım tepki için nazikçe 6 kez tüp flicking tarafından ekleyip karıştırın. Bir rotator Mikser RT, 20 rpm’de 30 dk metroyla döndürün. Spin aşağı 1.000 x g 2 için de örnek s RT. yerde 10 dakika süreyle manyetik bir raf tüp tüp manyetik raf tutmak ve süpernatant atın. Tüp manyetik raf tutmak, taze hazırlanmış % 70 etanol 400 μL Pelet bozmadan ekleyin. 30’dan sonra % 70 etanol kaldırmak s. 2.1.11 bir kez yineleyin. Spin aşağı 1.000 x g 2 için de örnek s RT. tüp manyetik rafa geri yerde. Herhangi bir kalıntı etanol kaldırmak ve 30 için Kuru hava s. Üzerinde Pelet kuru değil. Manyetik raf tüpü çıkarması ve 103 μL TE (10 mM Tris ve 1 mM EDTA, pH 8.0) ekleyin. Yavaşça flick boncuk arabellekte kaplıdır ve yavaşça 30 dakika süreyle RT, bir rotator Mikser üzerinde kuluçkaya sağlamak için tüp fiske tüp her 5 dk resuspension Pelet, yardım etmek için. En az 10 dk. Transfer 100 μL eluate ile geniş bir P200 ipucu 0.2 mL tüp içine delik için manyetik raf üstündeki cips. Son onarım ve dA-takip tepki bir 0.2 mL tüp 100 μL onarılan HMW DNA’ın, son onarım/dA-takip arabelleği 14 μL ve 7 μL son onarım/dA-takip karışımı ekleyerek hazırlayın. Yavaşça 6 kez flicking tarafından tepki mix ve Kaldır kabarcıklar aşağı spin. 60 dk 65 ° C 20 dk ardından 20 ° C’de tepki kuluçkaya ve 22 ° C’de basılı tutarak Örnek bir P200 geniş kullanarak yeni bir 1,5 mL tüp içine delik transfer ipucu. Manyetik boncuklar pipetting veya vortexing tarafından resuspend. 48 μL boncuk ekleyin (0,4 x) son onarım/dA-takip tepki ve karışımı yavaşça tüp 6 kez flicking tarafından. Bir rotator Mikser RT, 20 rpm’de 30 dk metroyla döndürün. Adımları 2.1.10-2.1.13 bir kez yinelenir. Manyetik raf tüpü çıkarması ve 33 μL TE (10 mM Tris ve 1 mM EDTA, pH 8.0) ekleyin. Yavaşça flick boncuk arabellekte kaplıdır ve yavaşça 30 dakika süreyle RT, bir rotator Mikser üzerinde kuluçkaya sağlamak için tüp fiske tüp her 5 dk resuspension Pelet, yardım etmek için. En az 10 dk. 30 Transfer μL eluate ile geniş bir P200 ipucu yeni 1,5 mL tüp içine delik için manyetik raf üstündeki cips. Bir yer kullanarak toplama algılamak için ilave 1-2 μL al.Not: Bu adımda 5-6 μg kurtarılması bekleniyor. Hazırlamak ekleyerek 30 μL tarafından 1.5 mL örnek tüp ligasyonu tepki son tamir HMW DNA’ın, 20 μL bağdaştırıcısı mix (AMX 1D) ve 50 μL blunt/TA ligasyonu ana karıştırın. Tepki hafifçe her ardışık toplama ve Kaldır kabarcıklar aşağı spin arasında 6 kez flicking tarafından karıştırın. RT, reaksiyon 60 dk için kuluçkaya. Manyetik boncuklar pipetting veya vortexing tarafından resuspend. 40 μL boncuk ekleyin (0,4 x) tüp ligasyonu tepki ve karışımı yavaşça tüp 6 kez flicking tarafından. Bir rotator Mikser RT, 20 rpm’de 30 dk metroyla döndürün. 2.1.10 bir kez yineleyin. Bağdaştırıcı boncuk bağlama (ABB) arabelleği 400 μL tüpün içine ekleyin. Tüp boncuk resuspend için 6 kere hafifçe vur. Tüp boncuk arabellek ayırmak ve süpernatant atmak için geri manyetik rafa yerleştirin. 2.1.26 bir kez yineleyin. Spin aşağı 1.000 x g 2 için de örnek s RT. tüp manyetik rafa geri yerde. Herhangi bir kalıntı arabellek kaldırmak ve 30 için Kuru hava s. Üzerinde Pelet kuru değil. Manyetik raf tüpü çıkarması ve Pelet elüsyon arabellek 43 μL içinde resuspend. Yavaşça flick boncuk arabellekte kaplıdır ve yavaşça 30 dakika süreyle RT, bir rotator Mikser üzerinde kuluçkaya sağlamak için tüp fiske tüp her 5 dk resuspension Pelet, yardım etmek için. En az 10 dk. 40 Transfer μL eluate ile geniş bir P200 ipucu yeni 1,5 mL tüp içine delik için manyetik raf üstündeki cips. Bir yer kullanarak toplama algılamak için ilave 1-2 μL al.Not: Bu adımda 1-2 μg kurtarılması bekleniyor. Mekanik yamultma tabanlı kitaplık yükleme için hazırdır. Kütüphanede buz en fazla 2 saat için sıralama için yükleme kadar gerekirse saklanabilir. Transposase parçalanma tabanlı kitaplık İnşaat Tezcan ( Tablo malzemelerigörmek) transposase dan reaktifleri kit. Parçalanma mix (FRA) ve karıştırmak için hızlı bağdaştırıcı (RAP) üzerinde buz ve pipet çözülme. Sıralama arabellek (SQB), boncuk (LB) yük çözülme, (FLB) tamponunu boşaltır ve urgan (FLT) RT, temizleme ve pipet karıştırmak için. RT ve pipet kullanmadan önce karıştırmak için yükleme boncuk (LB) çözülme. Bir kez çözdürülen, tüm kit bileşenleri buz üzerinde tutun. Yalnızca gerektiğinde enzimler al. Adım 1.21.2 HMW DNA’dan miktarı ve kalitesini kontrol edin. Pipet P200 geniş kullanarak HMW DNA tüp içinde üç farklı konumlardan yeni 1,5 mL tüpler içine DNA’ın 20 μL dışarı ipuçları verdi. Bir yer ve okuma bir UV kullanarak kalitesini kullanarak toplama algılamak için üç aliquots üzerinden 1 μL al. Görüntülenen sonuçları onaylamak için birden çok kez kontrol edin.Not: Beklenen sonuçları şekil 3B’ gösterilir. OD260/280 değeri yaklaşık 1,9 ve OD260/230 değeri yaklaşık 2.3. DNA tagmentation reaksiyon 0.2 mL tüp içinde 22 μL HMW DNA, 10 mm Tris (pH 8.0) ile %0,02 Triton X-100 ve 1 μL parçalanma (FRA) mix 1 μL ekleyerek hazırlayın. P200 geniş ile pipetting tarafından Mix ipucu mümkün olduğunca yavaş kabarcıklar tanıtmak değil dikkat çekici 6 kez, delik. 30 ° c için 1 dk 1 dk 80 ° C ardından tepki kuluçkaya ve 4 ° C’de basılı tutarak Transfer karışımı bir P200 geniş ile yeni bir 1,5 mL tüp içine çap ipucu ve hemen sonraki adım git. Hızlı bağdaştırıcısının (RAP) 1 μL 1,5 mL örnek tüp için ekleyin. P200 geniş ile pipetting tarafından Mix ipucu mümkün olduğunca yavaş kabarcıklar tanıtmak değil dikkat çekici 6 kez, delik. RT, reaksiyon 60 dk için kuluçkaya.Not: Transposase parçalanma tabanlı kitaplık yükleme için hazırdır. Kütüphanede buz en fazla 2 saat için sıralama için yükleme kadar gerekirse saklanabilir. 3. üstünde belgili tanımlık nanopore aygıt sıralama Nanopore sıralama aygıtı denetleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Hem yazılım ve donanım çalışıyoruz ve yeterli depolama alanı olduğundan emin olun. Akış hücre kontrol. Yeni bir akım hücre açın ve akış hücre nanopore cihazın içine yerleştirin. Kontrol kutusunu akışı hücre konumunun (X1-X5) eklenmiş. Doğru akım hücre tipi seçin. Akış hücreleri kontrol iş akışı üzerinde’yi tıklatın. Akış hücre QC analizi başlatmak için Testi Başlat düğmesini tıklatın.Not: bildirilen toplam etkin gözenek sayısı 800’den daha az ise, yeni ve farklı bir akış hücre sıralama için kullanın. Astar arabellek hazırlayın. Bir mekanik yamultma tabanlı kitaplık için çalışan yakıt karışımını (RBF) ile tampon ve 624 576 μL eklemek μL nükleaz ücretsiz su 1,5 mL tüp içine. Girdap ve karışımı macun arabellek aşağı spin. Transposase parçalanma tabanlı bir Kütüphane, floş urgan (FLT) 30 μL floş arabellek (FLB) tüp için ekleyin. Girdap ve karışımı macun arabellek aşağı spin. Akış cepten astar bağlantı noktası kapak astar bağlantı noktası ortaya çıkarmak için saat yönünde hareket. P1000 pipet için 100 μL ayarla ve ucu astar portuna takın. Geri akışı hücreden herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için arabellek (30’dan az μL) küçük bir hacim çizin. Sarı sıvı az miktarda bahşiş girer bir kez pipetting kes. P1000 pipet astar portu üzerinden akışı hücre içine astar Mix 800 μL yüklemek için kullanın. Kabarcıklar tanıtımı önlemek için 30 μL astar bağlantı noktasının ilk olarak, kapak sonra ucu astar portuna takın ve üst gerisi astar karışımı yavaş yavaş ekleyin için astar karışımı ekleyin. Yaklaşık 50 μL sol ucu almak. Astar karışımı macun bağlantı noktası üstünde kalan ekleyin. Sıvı içinde tek başına gidecek. 5 min için kuluçkaya için ayarları bırakın. Bu arada, Kütüphane içeren 1,5 mL tüp Kütüphane karışımda hazırlayın.Not: mekanik yamultma tabanlı kitaplık için arabellek DNA Kütüphane 40 µL için yakıt karışımını (RBF) ile çalışan 35 µL ekleyin. 34 µL sıralama arabelleği (SQB) ve 16 transposase parçalanma tabanlı kitaplık için eklemek µL nükleaz ücretsiz su 25 µL DNA Kütüphanesi için. Yavaşça örnek bağlantı noktası ortaya çıkarmak için akış hücre örneği bağlantı noktası kapağını açın. P1000 pipet astar bağlantı noktası üzerinden astar karışımı 200 μL 3.5 adımda anlatıldığı gibi akışı hücreye eklemek için kullanın. Astar mix örnek bağlantı noktası üzerinden akışı hücresine yüklü değil emin olun. P200 pipet 80 μL için ayarlayın. Kütüphane geniş geçişli ucu ile karışımı yavaşça yukarı ve aşağı hemen önce yükleme 6 kez pipetting. Kütüphane mix dropwise örnek bağlantı noktası üzerinden akışı hücre yükleyin. Sadece önceki açılan bağlantı noktasına tamamen yüklendiğinde her damla ekleyin. Örnek bağlantı noktası kapak yavaşça koy ve örnek bağlantı noktası tam olarak ele emin olun. Astar bağlantı noktası kapak astar bağlantı noktası karşılamak için saat yönünün tersine hareket. Aygıt kapağını kapatın. Yeni bir deneme iş akışı üzerinde’yi tıklatın. Kitaplık adı yazın, kullanılan yordamlar göre doğru takımı seçin ve ayarları doğru (48 koş, gerçek zamanlı Bankası-arama ON h) olduğundan emin olun. Başlat Çalıştır’ıtıklatın. 10 dakika sonra akışı hücre kimliği ve çalışma bilgi active nanopore numara (toplam sayısı ve her dört grup numaraları) kaydedin. Veri analizi. Verileri bir yerel bilgisayarı veya kümeyi nasıl yapılacağını veya çalışma tamamlandıktan sonra herhangi bir zamanda kopyalayın. Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2) başvuru genom dizisi verileri hizalama için kullanın. Ham sıralı veri ve hizalamaları olan sıralama performansı NanoPlot17 tarafından (https://github.com/wdecoster/NanoPlot) özetler.