JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingeniería

Ultra lange lezen Sequencing voor hele Genomic DNA-analyse

Published: March 15, 2019
doi:
10.3791/58954
, , , ,
1Genome Technologies,Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Summary

Lange-lezen sequenties vergemakkelijken aanzienlijk de assemblage van complexe genomen en karakterisering van structurele variatie. Beschrijven we een methode voor het genereren van ultra lange reeksen door sequentiebepaling nanopore gebaseerde platformen. De benadering neemt een geoptimaliseerde DNA-extractie, gevolgd door de gewijzigde bibliotheek preparaten voor het genereren van honderden kilobase leest met gematigde dekking van menselijke cellen.

Abstract

Derde generatie single-molecuul DNA sequencing technologieën aanzienlijk langer bieden Lees lengte die de vergadering van complexe genomen en analyse van complexe structurele varianten kan vergemakkelijken. Nanopore platforms uitvoeren van single-molecuul rangschikken door direct het meten van de huidige veranderingen gemedieerd door DNA passage door de poriën en honderden kilobase (kb) leest met minimale kapitaal kosten kunnen genereren. Dit platform is goedgekeurd door vele onderzoekers voor een verscheidenheid van toepassingen. Het bereiken van langere sequencing Lees lengtes is de meest kritische factor om de invloed van de waarde van de nanopore rangschikking platformen. Voor het genereren van ultra lange leest, is speciale aandacht vereist DNA-breuken te vermijden en zo de efficiëntie voor het genereren van productieve sequencing sjablonen. Wij bieden hier de gedetailleerde protocol van ultra lange DNA-sequencing met inbegrip van ultrahoog moleculair gewicht (HMW) DNA-extractie uit vers of bevroren cellen, bibliotheek bouw door mechanische schuintrekken of transposase fragmentatie, en het rangschikken op een nanopore apparaat. Van 20-25 µg HMW DNA, de methode N50 lezen lengte van 50-70 kb met mechanische Schuintrekken kunt bereiken en N50 van 90-100 kb Lees lengte met transposase gemedieerde fragmentatie. Het protocol kan worden toegepast op DNA van zoogdiercellen geëxtraheerd uit te voeren gehele genoom sequencing voor de detectie van structurele varianten en genoom vergadering. Aanvullende verbeteringen van de DNA-extractie en enzymatische reacties verlengt de Lees verder en het nut ervan uit te breiden.

Introduction

In het afgelopen decennium, massaal parallelle en zeer nauwkeurige tweede generatie high-throughput sequencing technologieën hebben gereden een explosie van biomedische ontdekking en technologische innovatie1,2,3. Ondanks de technische vooruitgang, de gegevens van de korte-lezen gegenereerd door de tweede generatie platforms zijn niet effectief bij het oplossen van complexe genomic regio’s en zijn beperkt in de opsporing van genomic structurele varianten (SVs), die een belangrijke rol in de mens spelen evolutie en ziekten4,5. Bovendien, korte-lezen gegevens zijn niet in staat om op te lossen herhaling variatie en zijn ongeschikt voor comforthotel haplotype fasering van genetische varianten6.

Recente vooruitgang in single-molecuul sequencing biedt aanzienlijk meer tijd lezen lengte, die de detectie van het volledige spectrum van SVs7,8,9, en biedt nauwkeurige en volledige vergadering van complex vergemakkelijken kan microbiële en zoogdieren genoom6,10. Het nanopore platform voert één-molecuul rangschikken door direct het meten van de huidige veranderingen gemedieerd door DNA passage door de poriën11,12,13. In tegenstelling tot elke bestaande DNA sequencing chemie, nanopore sequencing kunt genereren lange (tientallen tot duizenden kilobases) leest in real-time zonder zich het baseren op de kinetiek van de polymerase of kunstmatige versterking van het DNA-monster. Daarom, nanopore lang lezen sequencing (NLR-seq) houdt grote belofte voor het genereren van ultra lange Lees lengtes dan 100 kb, die zou verder sterk genomic en biomedische analyses14, met name in het lage-complexiteit of herhalen-rich regio’s van het genoom15.

De unieke eigenschap van de nanopore rangschikking is het potentieel voor het genereren van lange leest zonder een theoretische lengte beperking. Dus is de Lees lengte afhankelijk van de fysieke lengte van DNA die wordt rechtstreeks beïnvloed door de DNA-integriteit en de sequencing sjabloon kwaliteit. Bovendien, afhankelijk van de mate van manipulatie en het aantal stappen, zoals pipetting krachten en extractie voorwaarden, de kwaliteit van het DNA is zeer variabel. Daarom is het uitdagende voor een te lange leest door alleen toe te passen de standaard protocollen van de DNA-extractie en fabrikant meegeleverde bibliotheek bouwwijze opleveren. Richting van dit doel hebben we een robuuste methode voor het genereren van ultra lange rangschikken gegevens vanaf geoogste cel pellets (honderden kilobases) lezen. Wij hebben meerdere verbeteringen in de DNA-extractie en bibliotheek voorbereiding procedures aangenomen. Wij stroomlijnen het protocol als u wilt uitsluiten van geen onnodige procedures die de aantasting van het DNA en schade veroorzaken. Dit protocol is samengesteld uit hoge molecuulgewicht (HMW) DNA-extractie, ultra lange DNA bibliotheek constructie en rangschikken op een nanopore platform. Voor een goed opgeleide moleculair bioloog, meestal duurt het 6 h uit cel oogsten tot de voltooiing van HMW DNA-extractie, 90 min of 8 h voor bibliotheek bouw afhankelijk van de shearing methode, en tot een verdere 48u voor DNA sequencing. Het gebruik van het protocol zal de emancipatie van de Gemeenschap van de genomica te verbeteren van ons begrip van de complexiteit van het genoom en nieuw inzicht in de variatie van het genoom in ziekten bij de mens.

Protocol

Opmerking: Het NLR-seq-protocol bestaat uit drie achtereenvolgende stappen: 1) extractie van hoog-moleculair gewicht (HMW) genomic DNA; 2) ultra lange DNA bibliotheek bouw, waaronder fragmentatie van DNA HMW in de gewenste maten en Afbinding van DNA sequencing adapters eindigt; en 3) laden van de adapter-afgebonden DNA op de arrays van nanopores (Figuur 1). 1. HMW DNA-extractie Reagens setup. 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer (1000 mL) maken door toevoeging van 100 mL PBS (10 x) aan 900 mL water toe en meng goed. Lysis-buffermengsel (50 mL) maken door 43,5 mL water toe te voegen aan een tube van 50 mL. Voeg 500 μL van Tris (1 M, pH 8,0), natriumchloride (NaCl) (5 M), 1 mL 2,5 mL ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (0.5 M, pH 8,0) en 2,5 mL van het natrium dodecyl sulfaat (SDS) (10%, wt/vol) aan de buis en meng goed.Opmerking: Deze PBS buffer kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden. De premade lysis-buffermengsel kan worden achtergelaten bij RT voor maximaal 2 maanden. Controleer de sterfte in de cel en de cellen tellen. Zorg ervoor dat de levende verhouding > 85 is % en de cel Totaal aantal 30 x 106.Opmerking: De cellen die worden gebruikt in dit protocol zijn uit de cellijn van HG00733, een menselijke lymphoblastoid cellijn van Puerto Ricaanse afkomst wijd gebruikt in de 1000 genoom consortium voor structurele variatie analyse (zie tabel van materialen voor het bestellen van informatie), waartoe behoort aan internationale genoom monster Resource. De cellen verzamelen door centrifugatie bij 200 x g gedurende 5 min op RT. Discard het medium en resuspendeer de pellet cel (30 x 106 cellen) met 5 mL 1 x PBS buffer. Centrifugeer nogmaals bij 200 x g gedurende 5 min op RT en verwijder het supernatant.Let op: 25-35 x 106 cellen zijn aanvaardbaar voor deze aanpak. Meer moet variatie in de hoeveelheid cellen die worden gebruikt verdere optimalisatie. De cel pellet kan worden achtergelaten bij −80 ° C voor maximaal 6 maanden. Resuspendeer de pellet cel in 200 μL van 1 x PBS buffer. Als met behulp van een bevroren cel pellet, wassen met 5 mL 1 x PBS buffer. Centrifugeer de oplossing bij 200 x g gedurende 5 min op RT, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 200 μL van 1 x PBS buffer. Bereiden van 10 mL lysis-buffermengsel in een tube van 50 mL. Het toevoegen van de 200 μl celsuspensie aan de lysis-buffermengsel en vortex op de hoogste snelheid voor 3 s. Incubate de oplossing bij 37 ° C gedurende 1 uur. Voeg 2 μL van RNase A (100 mg/mL) toe aan de lysate. Zachtjes draaien de tube van 50 mL te mengen van het monster. Incubeer de oplossing bij 37 ° C gedurende 1 uur. Voeg 50 μl proteïnase K (20 mg/mL) toe aan de lysate. Zachtjes draaien de tube van 50 mL te mengen van het monster. Incubeer de oplossing bij 50 ° C gedurende 2 uur. Tijdens de incubatie, meng voorzichtig het monster elke 30 min. Verwijderen van de tube 50 mL vanaf 50 ° C en laat het staan op RT gedurende 5 minuten. Voeg 10 mL van de fenol laag van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, vol/vol/vol) naar de lysate en draaien van de buis op een rotator-mixer (Zie Tabel van materialen) op RT in een zuurkast bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten Wrap de dop van de tube met parafilm ter voorkoming van lekkage tijdens de rotatie. Twee 50 mL gel buizen (Zie Tabel of Materials) voor te bereiden door centrifugatie bij 1.500 x g gedurende 2 min op RT.Opmerking: De gel vormt een stabiele barrière tussen de waterfase van nucleic zuur-bevattende en de organisch oplosmiddel. Giet de oplossing van het monster/fenol in een van de voorbereide 50 mL gel buizen uit stap 1.10. Centrifugeer de oplossing bij 3000 x g gedurende 10 minuten op RT. Giet het supernatant in een nieuwe tube van 50 mL. Voeg 10 mL van de fenol laag van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, vol/vol/vol) en draai de buis op de mixer van een rotator op RT in een zuurkast bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten. Herhaal stap 1.11 eenmaal met de tweede bereid gel buis. Giet het supernatant in een nieuwe tube van 50 mL. Voeg 25 mL ijskoud 100% ethanol en zachtjes draai de buis met de hand totdat het DNA (Figuur 2 precipitaten).Opmerking: De neerslag benadering helpt om te stabiliseren de HMW DNA. Buig een 20 μL tip om een haak. Zorgvuldig Neem uit de HMW DNA met de haak en laat de daling van de vloeistof af. Plaats de HMW DNA in een tube van 50 mL met 40 mL 70% ethanol. Het DNA door voorzichtig omkeren de buis 3 keer wassen. Herhaal stap 1.15 eenmaal voor het verzamelen van DNA uit de buis 70% ethanol. Plaats de HMW DNA in een tube van 2 mL, met 1.8 mL 70% ethanol. Centrifugeer het gewassen HMW DNA bij 10.000 x g gedurende 3 s RT. verwijderd zo veel van de resterende ethanol mogelijk door pipetteren.Opmerking: Niet storen de DNA-pellet wanneer de resterende ethanol pipetteren. Incubeer de tube 2 mL bij 37 ° C gedurende 10 minuten met het deksel open voor het drogen van het monster. Als verdergaat met stap 2.1 (met mechanische schuintrekken en 1 D afbinding Sequencing Kit), voeg 1 mL TE (10 mM Tris en 1 mM EDTA, pH 8,0) aan de 2 mL-buis. Als verdergaat met stap 2.2 (met transposase gebaseerde fragmentatie en snelle Sequencing Kit), het toevoegen van 200 μl van 10 mM Tris (pH 8.0) met 0,02% Triton X-100.Opmerking: Niet storen de DNA-pellet. Verhuur van de buis gedurende 48 uur bij 4 ° C in het donker staan, zal het monster volledig resuspendeer helpen. HMW DNA kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 2 weken. Langere opslagtijd of andere opslagcondities kunnen invoeren meer korte fragmenten. 2. ultra lange DNA bibliotheek bouw Opmerking: Er zijn twee manieren om te bouwen van de ultra lange DNA-bibliotheken op basis van twee verschillende schuintrekken methoden in combinatie met nanopore sequencing kits. Een mechanische schuintrekken gebaseerde bibliotheek produceert gegevens met een N50 van 50-70 kb, nemen ongeveer 8 h voor de bouw van de bibliotheek. Een transposase op basis van fragmentatie bibliotheek produceert een N50 van 90-100 kb gegevens, nemen slechts 90 min voor de bouw van de bibliotheek. Het mechanische schuintrekken protocol geeft hogere opbrengst van het hetzelfde DNA ingang met een identieke versie van sequencing adapter en kwaliteit van nanopore stroom cellen. Mechanische schuintrekken gebaseerde bibliotheek bouw Ontdooien en mix de reagentia van de afbinding kit (Zie Tabel van materialen). Dooi FFPE DNA herstel buffer en einde reparatie/dA-tailing buffer op het ijs, dan vortex en spin tot mix. Ontdooi adapter mix (AMX) en adapter kraal bindende buffer (ABB) op het ijs, dan de pipet en de spin naar beneden te mengen. Dooi rennen buffer met brandstofmix (RBF) en elutie buffer (ELB) op de RT, dan vortex en spin te mengen. Ontdooi bibliotheek kralen (LLB) laden op RT en Pipetteer te mengen vóór gebruik. Houd alle onderdelen van de kit op het ijs eenmaal ontdooid. Haal de enzymen alleen wanneer nodig. De magnetische kralen brengen door RT voor gebruik.Opmerking: Zie de tabel van materialen voor aanbevelingen over de magnetische kralen te gebruiken. Controleer de kwaliteit en de kwantiteit van de HMW DNA uit stap 1.21.1. Pipetteer uit 20 μL van DNA in nieuwe 1,5 mL buizen vanaf drie verschillende locaties in de HMW DNA-buis met behulp van P200 breed droeg tips. Neem 1 μL van de drie aliquots te sporen van de concentratie met behulp van een Fluorimeter en de kwaliteit met behulp van een UV lezen. Controleer malen meerdere om de resultaten te bevestigen.Opmerking: De verwachte resultaten worden weergegeven in figuur 3A. De OD-waarde van260/280 is ongeveer 1.9 en de260/230 OD-waarde is ongeveer 2.3. Overdracht van de resterende 940 μL van HMW DNA in een 50 mL tube dop met een brede P1000 droeg tip. Alle DNA gecombineerd in een 1 mL spuit zonder de naald. De 27 G naald op de spuit gezet en werpen van alle DNA in het GLB voorzichtig en langzaam (~ 10 s). Opstijgen de 27 G naald van de spuit. Herhaal stap 2.1.4 en 2.1.5 voor 29 keer voor een totaal van 30 passeert via de naald.Opmerking: De sheared HMW DNA kan worden achtergelaten bij 4 ° C in het donker voor maximaal 24 h. kwaliteitscontrole (QC) sterk door pulsed field gelelektroforese aanbevolen is, maar het is duur en tijdrovend. Als QC uitvoeren op een geautomatiseerde pulse veld gel elektroforese machine een 5 tot 150 kb-protocol te gebruiken voor een 20 h uitvoeren. De verwachte resultaten worden weergegeven in Figuur 4. Voorbereiden van de DNA-reparatie-reactie in een 0,2 mL-buis door toevoeging van 100 μl van sheared HMW DNA (20 μg), 15 μL van FFPE DNA reparatie buffer, 12 μL van FFPE DNA reparatie mix en 16 μL van de nuclease-gratis water. Meng de reactie door flicking zachtjes 6 keer, en draaien tot verwijderen bubbels. De reactie bij 20 ° C gedurende 60 min. overdracht Incubeer het monster in een nieuwe 1,5 mL-buis met een P200 breed boring tip. Resuspendeer de magnetische kralen door pipetteren of vortexing. 143 μL kralen (1 x) aan de DNA-reparatie-reactie en meng zachtjes toevoegen door flicking de buis 6 keer. De buis op de mixer van een rotator op RT bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten draaien. Spin down het monster bij 1.000 x g voor 2 s op RT. plaats de buis op een magnetische rek voor 10 min. de buis op het magnetische rek houden en de vloeistof wordt weggeworpen. Houd de buis op het magnetische rek, 400 μL van vers bereide 70% ethanol toevoegen zonder de pellet te verstoren. Verwijder de 70%-ethanol na 30 s. Herhaal stap 2.1.11 eens. Spin down het monster bij 1.000 x g voor 2 s op RT. plaats de buis terug op het magnetische rek. Verwijder eventuele resterende ethanol en lucht droog voor 30 s. Niet meer dan de pellet drogen. Verwijder de buis uit het magnetische rek en voeg 103 μL van TE (10 mM Tris en 1 mM EDTA, pH 8,0). Zachtjes flick flick de buis om ervoor te zorgen dat de kralen in de buffer vallen, en op een rotator mixer op RT voor 30 min. zachtjes broeden de buis elke 5 min steun resuspensie van de pellet. Pellet de kralen op het magnetische rek voor ten minste 10 min. Transfer 100 μl van het eluaat met een brede P200 droeg tip in een tube van 0,2 mL. Het einde reparatie en dA-tailing reactie in een 0,2 mL-buis door toevoeging van 100 μl van gerepareerde HMW DNA, 14 μL van einde reparatie/dA-tailing buffer en 7 μL van einde reparatie/dA-tailing mix voorbereiden. Meng de reactie door flicking zachtjes 6 keer, en draaien tot verwijderen bubbels. Incubeer de reactie bij 20 ° C gedurende 60 minuten gevolgd door 65 ° C gedurende 20 min en houdt vervolgens bij 22° C. Overdracht van het monster af in een nieuwe 1,5 mL-buis met behulp van een breed P200 droeg tip. Resuspendeer de magnetische kralen door pipetteren of vortexing. Toevoegen van 48 μL van kralen (0,4 x) aan het einde reparatie/dA-tailing reactie en meng zachtjes door flicking de buis 6 keer. De buis op de mixer van een rotator op RT bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten draaien. Herhaal stappen 2.1.10-2.1.13 eens. Verwijder de buis uit het magnetische rek en voeg 33 μL van TE (10 mM Tris en 1 mM EDTA, pH 8,0). Zachtjes flick flick de buis om ervoor te zorgen dat de kralen in de buffer vallen, en op een rotator mixer op RT voor 30 min. zachtjes broeden de buis elke 5 min steun resuspensie van de pellet. Pellet de kralen op het magnetische rek voor ten minste 10 min. 30 Transfer μL van eluaat met een brede P200 droeg tip in een nieuwe 1,5 mL-buis. Neem de extra 1-2 μL te sporen van de concentratie met behulp van een fluorescentiespectroscopie.Opmerking: Herstel van 5-6 μg bij deze stap wordt verwacht. De reactie van de afbinding in het monsterbuisje 1,5 mL door toe te voegen 30 μL van einde herstelde HMW DNA, 20 μL van adapter mix (AMX 1D) en 50 μl van bot/TA afbinding master mix voor te bereiden. Meng de reactie door flicking zachtjes 6 keer tussen elke sequentiële toevoeging en de spin tot verwijderen bubbels. Incubeer de reactie op RT voor 60 min. Resuspendeer de magnetische kralen door pipetteren of vortexing. Voeg toe 40 μL kralen (0,4 x) aan de afbinding reactie en meng zachtjes door flicking de buis 6 keer. De buis op de mixer van een rotator op RT bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten draaien. Herhaal stap 2.1.10 eens. Voeg 400 l adapter kraal bindende (ABB) buffer in de buis. Flick de tube zachtjes 6 keer aan resuspendeer de kralen. Plaats de buis terug op het magnetische rek te scheiden van de parels uit de buffer en weggeworpen. Herhaal stap 2.1.26 eens. Spin down het monster bij 1.000 x g voor 2 s op RT. plaats de buis terug op het magnetische rek. Verwijder eventuele resterende buffer en lucht droog voor 30 s. Niet meer dan de pellet drogen. Verwijderen van de buis van de magnetische rack en resuspendeer de pellet in 43 μL van elutie buffer. Zachtjes flick flick de buis om ervoor te zorgen dat de kralen in de buffer vallen en incubeer op een rotator mixer op RT voor 30 min. zachtjes de buis elke 5 min steun resuspensie van de pellet. Pellet de kralen op het magnetische rek voor ten minste 10 min. 40 Transfer μL van eluaat met een brede P200 droeg tip in een nieuwe 1,5 mL-buis. Neem de extra 1-2 μL te sporen van de concentratie met behulp van een fluorescentiespectroscopie.Opmerking: Herstel van 1-2 μg bij deze stap wordt verwacht. De mechanische schuintrekken gebaseerde bibliotheek is klaar voor laden. De bibliotheek kan worden opgeslagen in de ijskast voor tot 2 h tot laden voor het rangschikken indien nodig. Transposase op basis van fragmentatie bibliotheek bouw Dooi de reagentia van de transposase kit (Zie Tabel van materialen). Ontdooi fragmentatie mix (FRA) en snelle adapter (RAP) op ijs en Pipetteer te mengen. Ontdooien volgorde buffer (SQB), laden kralen (LB), spoelen buffer (FLB) en spoel ketting (FLT) op RT en Pipetteer te mengen. Ontdooi laden kralen (LB) op RT en Pipetteer te mengen vóór gebruik. Houd alle onderdelen van de kit op het ijs eenmaal ontdooid. Haal de enzymen alleen wanneer nodig. Controleer de kwaliteit en de kwantiteit van de HMW DNA uit stap 1.21.2. Pipetteer uit 20 μL van DNA in nieuwe 1,5 mL buizen vanaf drie verschillende locaties in de HMW DNA-buis met behulp van P200 breed droeg tips. Neem 1 μL van de drie aliquots te sporen van de concentratie met behulp van een Fluorimeter en de kwaliteit met behulp van een UV lezen. Controleer malen meerdere om de resultaten te bevestigen.Opmerking: De verwachte resultaten worden weergegeven in figuur 3B. De OD-waarde van260/280 is ongeveer 1.9 en de260/230 OD-waarde is ongeveer 2.3. Bereiden de DNA tagmentation reactie in een 0,2 mL-buis door 22 μL van HMW DNA, 1 μL van 10 mM Tris (pH 8.0) met 0,02% Triton X-100 en 1 μL van fragmentatie mix (FRA) toe te voegen. Meng door pipetteren met een brede P200 droeg tip zo langzaam mogelijk 6 keer, verzorgen niet in te voeren van de bubbels. Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 1 min gevolgd door 80 ° C voor 1 min en houdt vervolgens bij 4 ° C. Overdracht de mix in een nieuwe 1,5 mL-buis met een brede P200 droeg tip en ga naar de volgende stap onmiddellijk. 1 μL van snelle adapter (RAP) aan het monsterbuisje 1,5 mL toevoegen. Meng door pipetteren met een brede P200 droeg tip zo langzaam mogelijk 6 keer, verzorgen niet in te voeren van de bubbels. Incubeer de reactie op RT voor 60 min.Opmerking: De transposase op basis van fragmentatie bibliotheek is klaar voor laden. De bibliotheek kan worden opgeslagen in de ijskast voor tot 2 h tot laden voor het rangschikken indien nodig. 3. sequencing op het nanopore-apparaat Controleer de nanopore sequencing apparaat (Zie Tabel van materialen). Zorg ervoor dat zowel de software en hardware werkt, en er is genoeg opslagruimte. Controleer de stroom-cel. Open een nieuwe stroom cel en de stroom cel invoegen het nanopore apparaat. Controleer dat het vak van de locatie van de stroom-cel werd ingevoegd (X1-X5). Selecteer de juiste flow celtype. Klik op de werkstroom Controleren stromen cellen . Klik op de knop Test starten om te beginnen met de stroom cel QC analyse.Opmerking: Als de gemelde totale actieve porie-getal minder dan 800 is, gebruik een andere nieuwe stroom cel voor het rangschikken. Bereiden de priming-buffer. Voor een mechanische schuintrekken gebaseerde bibliotheek, het toevoegen van 576 μL van de exploitatie van de buffer met brandstofmix (RBF) en 624 μL van de nuclease-gratis water in een 1,5 mL-buis. Vortex en spin tot mix de priming-buffer. Voor een transposase op basis van fragmentatie bibliotheek, voeg toe 30 μL van flush ketting (FLT) aan de buis van flush buffer (FLB). Vortex en spin tot mix de priming-buffer. Van de cel van de stroom, verplaatsen de priming poort cover rechtsom om de priming poort bloot te stellen. Een pipet P1000 ingesteld op 100 μl en breng de tip in de priming-poort. Trek u terug een klein volume van buffer (minder dan 30 μL) naar alle bubbels verwijderen uit de stroom-cel. Stop pipetteren zodra een kleine hoeveelheid gele vloeistof de tip. Gebruik een pipet P1000 te laden 800 μL van de priming mix in de cel van de stroom via de priming-poort. Toevoegen om te voorkomen dat de invoering van bubbels, 30 μL van de priming mix te dekken van de bovenkant van de priming poort eerst, dan sluit de tip op de priming-poort en voeg langzaam de rest van de priming mix. Neem de tip wanneer er ongeveer 50 μl links. Voeg de rest van priming mix op de bovenkant van de priming-poort. De vloeistof zal vanzelf naar binnen gaan. Laat de installatie toe Incubeer gedurende 5 min. In de tussentijd bereidt de mix van de bibliotheek in de 1,5 mL-buis met de bibliotheek.Opmerking: Voor een mechanische schuintrekken gebaseerde bibliotheek toevoegen 35 µL van het runnen van de buffer met brandstofmix (RBF) tot 40 µL van de bibliotheek van DNA. Voor een transposase op basis van fragmentatie bibliotheek toevoegen 34 µL van sequencing buffer (SQB) en 16 µL nuclease-gratis water tot 25 µL van de bibliotheek van DNA. Open het klepje van stroom cel monster poort zachtjes om de poort monster bloot te stellen. Gebruik een pipet P1000 toe te voegen 200 μL van de priming mix via de priming-poort in de cel van de stroom, zoals beschreven in stap 3.5. Zorg ervoor dat de priming mix niet in de cel van de stroom via de poort van de steekproef geladen wordt. Een pipet P200 ingesteld op 80 μL. Meng de bibliotheek zachtjes met een brede boring tip door pipetteren op en neer 6 keer net vóór het laden. Laad de bibliotheek mix ontkleuring via de poort van het monster in de cel van de stroom. Voeg elke druppel pas na de eerdere daling volledig is geladen in de haven is. Zet terug de monster poort cover voorzichtig en zorg ervoor dat de poort van de steekproef is volledig bedekt. Verplaats de priming poort cover tegenwijzerzin ter dekking van de priming-poort. Sluit het deksel van het apparaat. Klik op de Nieuwe Experiment workflow. Typ de naam van de bibliotheek, selecteren van de juiste kit volgens procedures gebruikt en controleer of de instellingen correct (48 h uitvoeren zijn, real-time base-roept ON). Klik op Run beginnen. Na 10 min, registreren de stroom cel-ID en de actieve nanopore nummers (totale aantal en elke vier groepen getallen) uit de uitvoering informatie. Data-analyse. De gegevens kopiëren naar een lokale computer of een cluster op elk gewenst moment van de volgorde en wanneer de run voltooid is. Gebruik Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2) om de reeks gegevens uitlijnen op de referentie-genoom. Het samenvatten van de prestaties van de volgorde van de ruwe sequencedata en de uitlijning door NanoPlot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot).

Representative Results

Het ultra lange DNA sequencing protocol geldt HMW DNA voor bibliotheek bouw. Daarom is het essentieel om te kiezen van goed gekweekte cellen met de levende verhouding > 85% bij de cel oogsten stap. Het bedrag van de cellen die worden gebruikt voor DNA-extractie zal van invloed zijn op de kwaliteit en de kwantiteit van de HMW DNA. De lysis van de cel werkt niet goed als begint met te veel cellen. Te weinig cuvetten genereert geen voldoende DNA voor bibliotheek bouw omdat de HMW DNA neerslag wordt uitgevoerd met behulp van zachte rotatie met de hand in plaats van snelle centrifugeren. Een voorbeeld van het DNA van de HMW nadat ijskoude 100% ethanol toe te voegen en roterende wordt weergegeven als het witte katoen-achtige neerslag in Figuur 2. Het is belangrijk om de kwaliteit van de input DNA controleren voordat u begint met de bouw van de bibliotheek. Afbraak, onjuiste kwantificering, verontreiniging (b.v., eiwitten, RNAs, detergentia, oppervlakteactieve stof, en resterende fenol of ethanol) en lage moleculaire gewicht DNA kan een significant effect op de daaropvolgende procedures en op de finale Lees lengte hebben. Het is raadzaam voor het uitvoeren van de QC-analyse met behulp van het DNA van drie verschillende locaties in de buis met HMW DNA. Van UV het lezen van de resultaten voor de HMW DNA, de OD-waarde voor280 260/OD is ongeveer 1.9 en de OD-waarde voor230 260/OD is ongeveer 2.3 (figuur 3AB). Deze verhouding waarden stroken onder de drie proeven voor een goede HMW DNA-monster. Verschillende schuintrekken methoden vereist verschillende volumes van input DNA. De concentratie van HMW DNA moet > 200 ng/µL voor mechanische schuintrekken terwijl het moet > 1 µg/µL voor versnippering van de transposase. De concentratie gedetecteerd door een Fluorimeter is een beetje lager dan UV lezen. De variatiecoëfficiënt van de concentratie van de dezelfde HMW DNA-monster is echter vereist op minder dan 15% met zowel de Fluorimeter en de UV-lezen van testen. Mechanische schuintrekken geldt een injectiespuit met een naald te breken het DNA HMW zodat het aantal passeert de naald invloed op de grootte van de sheared DNA hebben zal en de finale lengte lezen. Het is raadzaam voor het uitvoeren van grootte QC nadat naald Schuintrekken om ervoor te zorgen de meerderheid van de HMW DNA groter dan 50 kb is zoals geïllustreerd in Figuur 4. In de mechanische schuintrekken methode gegenereerd 30 passeert de beste rangschikkend resultaten gezien van zowel de lengte als de uitvoer. De N50 van een mechanische schuintrekken gebaseerde bibliotheek is 50-70 kb, terwijl een transposase op basis van fragmentatie bibliotheek 90-100 kb is. De resultaten van vier runs met behulp van de cellijn van HG00733 staan in tabel 1. Alle vier punten hebben meer dan 2.300 leest met lengte langer zijn dan 100 kb. De maximale lengte is langer in de transposase fragmentatie-bibliotheken (455 kb en 489 kb) in vergelijking met de mechanische scheren-bibliotheken (348 kb en 387 kb) terwijl laatstgenoemde geproduceerd meer totale leest, geven een hoger rendement. De transposase bibliotheek fragmentatie gebaseerde bouw heeft minder stappen en kortere voorbereidingstijd zodat het minder korte fragmenten zal introduceren. De twee runs toe met behulp van transposase hebben een langere gemiddelde lengte (> 30 kb) en gemiddelde lengte (> 10 kb). Daarnaast toont de gegevens constante hoge kwaliteit in alle runs (gemiddelde kwaliteitsscore is ongeveer 10.0, ~ 90% basis nauwkeurigheid). Meer dan 97% van de totale honken werden uitgelijnd aan de menselijke referentie genoom (hg19) Minimap216 met de standaardinstellingen. De verwachte grootte verdelingen van de ruwe leest zijn afgebeeld in Figuur 5. Alle sessies hebben een groot aantal gegevens boven 50 kb terwijl transposase fragmentatie gebaseerde bibliotheken een hogere ratio van ultra lange luidt (b.v. > 100 kb hebben). Dit protocol is succesvol toegepast in meerdere menselijke cellijnen (aanvullende tabel 1). Figuur 1: Schematisch overzicht van de workflow van de lange-lezen sequencing (NLR-seq) nanopore. Oranje, de complexe transposase. Geel-groen, de nanopore-adapter. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: vertegenwoordiger DNA neerslag van fenol-chloroform extractiemethode. De witte pijl geeft de HMW DNA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: voorbeeld QC resultaten van DNA uit UV lezing HMW. (A) HMW DNA uit stap 1.21.1 klaar voor mechanische schuintrekken gebaseerde bibliotheek bouw. (B) HMW DNA uit stap 1.21.2 voor transposase op basis van fragmentatie bibliotheek bouw. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: QC resultaten van de naald geschoren HMW DNA door pulsed field gelelektroforese. L1: Quick-load 1 kb DNA ladder; L2: Quick-load 1 kb DNA-ladder uit te breiden. 1-8: DNA met verschillende passerende tijd via de naald schuintrekken. 1-3, geen schuintrekken; 4, 10 keer; 5, 20 keer; 6, 30 keer; 7, 40 keer; 8, 50 keer. Deze QC stap is optioneel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: verwacht distributies van de grootte van de nanopore ultra lange DNA bibliotheken. MS, mechanische scheren-bibliotheken. TF, transposase fragmentatie-bibliotheken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Mechanische shearing_rep1 Mechanische shearing_rep2 Transposase fragmentation_rep1 Transposase fragmentation_rep2 Cellijn HG00733 HG00733 HG00733 HG00733 N50 van de leest 55,180 63,007 98,237 95,629 Aantal leest langer zijn dan 100 Kb 2.500 3,082 2,386 2,355 Aantal totale leest 97,859 80,465 24,166 21,032 Maximale lengte (bp) 348,482 387,113 454,660 489,426 Gemiddelde lengte (bp) 17,861 20,395 33,528 38,175 Gemiddelde lengte (bp) 5,335 5,894 10,249 15,656 Gemiddelde kwaliteit van de leest 10.0 10.1 9,9 10.0 Totale basissen van ruwe luidt 1,747,849,822 1,641,058,932 810,229,733 802,886,304 Totale basissen van uitgelijnde luidt 1,693,300,832 1,607,975,925 791,422,077 778,417,627 Toegewezen verhouding van totale bases (hg19, Minimap2) 96.9% 98,0% 97,7% 97,0% Aantal actieve poriën 1225: 480, 402, 254, 89 1058: 480, 356, 176, 46 958: 452, 328, 148, 30 1092: 487, 367, 195, 43 Tabel 1: Samenvatting van prestatiegegevens uitgevoerd met verschillende schuintrekken protocollen. Bibliotheek 1 Bibliotheek 2 Cellijn K562 GM19240 Cel bestelinformatie ATCC, kat. Nr. CCL-243 Coriell Instituut, kat. Nr. GM19240 Protocol mechanische schuintrekken mechanische schuintrekken N50 van de leest 60,063 55,295 Aantal totale leest 193,783 120,807 Gemiddelde lengte (bp) 1,843 4,688 Gemiddelde lengte (bp) 9,825 17,408 Maximale lengte (bp) 548,780 212,338 Totale basissen van ruwe luidt 1,903,989,686 2,103,015,331 Totale basissen van uitgelijnde luidt 1,837,350,047 1,997,419,761 Toegewezen verhouding van totale bases (hg19, Minimap2) 96,6% 95.0% Aantal actieve poriën 1111: 482, 371, 203, 55 1032: 447, 333, 196, 56 Aanvullende tabel 1: Samenvatting van twee NLR-seq runs andere cellijnen met het mechanische schuintrekken protocol.

Discussion

In principe is nanopore rangschikken kundig voor genereren van 100 kb aan megabase leest in lengte11,12,13. Vier belangrijke factoren zullen de prestaties van de sequencing uitvoeren en gegevens kwaliteit beïnvloeden: 1) actieve porie nummers en de activiteit van de poriën; 2) motor-eiwit, dat regelt de snelheid van DNA door de nanopore; 3) DNA sjabloon (lengte, zuiverheid, kwaliteit, massa); 4) sequencing adapter afbinding efficiëntie, die bepalend is voor de bruikbare DNA uit de input monster. De eerste twee factoren, is afhankelijk van de versie van de cel van de stroom en de sequencing kit geleverd door de fabrikant. De laatste twee factoren zijn kritische stappen in dit protocol (HMW DNA-extractie, schuintrekken en afbinding).

Dit protocol vereist geduld en oefening. De kwaliteit van HMW DNA is belangrijk voor ultra lange DNA bibliotheken6. Het protocol start met cellen verzameld met hoge levensvatbaarheid (> 85% levensvatbare cellen de voorkeur), beperking van de aangetaste DNA uit dode cellen. Iedere harde methode die schade met het DNA kennismaken kan (bijvoorbeeld sterk verstoren, schudden, vortex, meerdere pipetting, herhaalde bevriezen en ontdooien) moet worden vermeden. In het ontwerp van het protocol weglaten we pipetteren in het gehele proces van de DNA-extractie. Breed boring uiteinden moeten worden gebruikt wanneer pipetteren is nodig na de mechanische scheren tijdens de bouw van de bibliotheek en de sequencing. Als de nanopores gevoelig voor de chemicaliën in de kamer buffer12 zijn, moet er zo weinig resterende verontreinigingen (bijvoorbeeld de detergentia, oppervlakteactieve stoffen, fenol, ethanol, eiwitten RNAs, enz) mogelijk in het DNA. Gezien de lengte en de opbrengst toont de fenol-extractiemethode de resultaten van het beste en meest reproduceerbare vergeleken met meerdere verschillende extractiemethoden getest tot nu toe.

Ondanks het vermogen van dit protocol te produceren van lange-lezen sequenties, blijven verschillende beperkingen. Ten eerste, dit protocol werd geoptimaliseerd op basis van het nanopore sequencing apparaat beschikbaar ten tijde van publicatie; Dus, het is beperkt tot de sequentiebepaling van selectieve nanopore gebaseerde chemie en zou suboptimaal wanneer uitgevoerd in andere soorten lange-lezen sequencing apparaten. Ten tweede, het resultaat is sterk afhankelijk van de kwaliteit van het DNA geëxtraheerd uit het uitgangsmateriaal (weefsels of cellen). Lees lengte zal worden aangetast als de startende DNA is al gedegradeerd of beschadigd. Ten derde, hoewel meerdere QC stappen zijn opgenomen in het protocol bij het controleren van de kwaliteit van DNA, de definitieve opbrengst en de lengte van de leest kunnen worden beïnvloed door de stroom-cel en poriën activiteit, die zou variabele in dit vroege stadium van nanopore sequencing platform ontwikkeling.

Het protocol beschreven gebruikt hier menselijke schorsing celsteekproeven lijn voor DNA-extractie. We hebben de passerende times in naald schuintrekken, de HMW DNA in verhouding tot de transposase en de tijd van de afbinding tot beschreven resultaten geoptimaliseerd. Het protocol kan op vier manieren worden uitgebreid. Eerst, kunnen de gebruikers beginnen met andere gekweekte zoogdiercellen en met verschillende hoeveelheid cellen, weefsels, klinische monsters of andere organismen. Verdere optimalisatie op lysis van de incubatietijd, reactie volume en centrifugeren nodig zullen zijn. Ten tweede, het is moeilijk te voorspellen het doelformaat voor het ultra lange Lees rangschikken. Als de Lees lengtes korter zijn dan verwacht, kunnen de gebruikers aanpassen van de passerende tijden in de mechanische schuintrekken gebaseerde methode of de verhouding van het DNA HMW omzetten in transposase in de transposase fragmentatie gebaseerde methode. Langere binding en elutie tijd tijdens cleanup stappen zijn handig omdat het HMW DNA is zeer viskeuze. Ten derde, met verschillende nanopore sequencing apparaten, kunt een aanpassen de hoeveelheid en het volume van het DNA om te voldoen aan de criteria van de sequencer. Ten vierde, zal alleen deze DNA afgebonden aan sequencing adapters worden sequenced. Om afbinding efficiëntie verder te verbeteren, kan men proberen om te Titreer de adapter en ligase concentraties. Gemodificeerde afbinding tijd en moleculaire omvangrijke agenten zoals PEG18 kunnen in de toekomst worden toegepast. Het ultra lange DNA sequencing protocol gecombineerd met CRISPR19,20 kan bieden een doeltreffend instrument voor het doel verrijking rangschikken.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Y. Zhu bedanken de auteurs voor haar opmerkingen over het manuscript. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award nummer P30CA034196. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

Reagents
Absolute ethanol Sigma-Aldrich E7023
Agencourt AMPure XPbeads Beckman A63881 magnetic beads for cleanup
BD conventional needles Becton Dickinson 305136 27G, for mechanical shearing
BD Luer-Lok syringe Becton Dickinson 309628 for mechanical shearing
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228 for cell counting
EDTA Invitrogen AM9261 pH 8.0, 0.5 M, 500 mL
Flow Cell Oxford Nanopore Technologies FLO-MIN106 R9.4.1
HG00773 cells Coriell Institute HG00733 cells used in this protocol
Ligation Sequencing Kit 1D Oxford Nanopore Technologies SQK-LSK108 nanopore ligation kit
MaXtract High Density tubes Qiagen 129073 gel tubes
NEBNext FFPE DNA Repair Mix NEB M6630S
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB M7546S
Nuclease-free water Invitrogen AM9937
Phosphate-Buffered Saline, PBS Gibco 70011044 10X, pH 7.4
Phenol:chloroform:IAA Invitrogen AM9730
Proteinase K Qiagen 19131 20 mg/mL
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorometer assays for DNA quantification
Rapid Sequencing Kit Oxford Nanopore Technologies SQK-RAD004 nanopore transposase kit
RNase A Qiagen 19101 100 mg/mL
SDS Invitrogen AM9822 10% (wt/vol)
Sodium chloride solution Invitrogen AM9759 5.0 M
TE buffer Invitrogen AM9849 pH 8.0
Tris Invitrogen AM9856 pH 8.0, 1 M
Triton X-100 solution Sigma-Aldrich 93443 ~10%
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bio-Rad C1000 Thermal Cycler Bio-Rad 1851196EDU
Centrifuge 5810R Eppendorf 22628180
Countess II FL Automated Cell Counter Life Technologies AMQAF1000 for cell counting
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D magnetic rack
Eppendorf ThermoMixer Eppendorf 5382000023 for incubation
Freezer LabRepCo LHP-5-UFMB
GridION Oxford Nanopore Technologies GridION X5 nanopore device used in this protocol
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D rotator mixer
MicroCentrifuge Benchmark Scientific C1012
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-1000 for UV reading
Pippin Pulse Sage Science PPI0200 pulsed-field gel electrophoresis instrument
Qubit 3.0 Fluorometer Invitrogen Q33216 fluorometer
Refrigerator LabRepCo LABHP-5-URBSS
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-A236
Water bath VWR 89501-464
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).
  2. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  3. Shendure, J., et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
  4. Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. Genome structural variation discovery and genotyping. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).
  5. Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease. Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).
  6. Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. Long reads: their purpose and place. Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).
  7. Cretu Stancu, M., et al. Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing. Nature Communications. 8 (1), 1326 (2017).
  8. Gong, L., et al. Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads. Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).
  9. Sedlazeck, F. J., et al. Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing. Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).
  10. Jain, M., et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).
  11. Jain, M., et al. Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer. Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).
  12. Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).
  13. Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biology. 17 (1), 239 (2016).
  14. Editorial, The long view on sequencing. Nature Biotechnology. 36 (4), 287 (2018).
  15. Jain, M., et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome. Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).
  16. Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).
  17. De Coster, W., D’Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).
  18. Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. Impact of macromolecular crowding on DNA replication. Nature Communications. 4, 1615 (2013).
  19. Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping. bioRxiv. , (2017).
  20. Gabrieli, T., et al. Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH). Nucleic Acids Research. , (2018).

Tags

Ultra-long Read SequencingWhole Genomic DNA AnalysisHigh-molecular Weight DNARepeat Expansion DisordersHLA-typingPrecision MedicineDNA ExtractionMechanical ShearingLibrary Preparation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Gong, L., Wong, C., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58954, doi:10.3791/58954 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image