Zebrafish 애벌레에 음식 감염에 대 한 차량으로 Protozoan Paramecium caudatum 를 사용 하 여

Zebrafish 관리, 번 식, 그리고 여기에 설명 된 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드를 따라 하 고 텍사스 대학 보건 과학 센터, 프로토콜의 기관 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었습니다. 숫자 AWC-16-0127입니다. 1. 성장 및 Paramecia 의 유지 보수 소스 Zebrafish 국제 리소스 센터 (ZIRC) 등에서 라이브 paramecia 문화를 가져옵니다. Paramecia 문화, 1에서 resuspended는 대장균 MG1655 문화 (광학 밀도 OD600 1.0-2.0)의 1 mL의 1 mL을 추가 라이브 성장 문화에서 x E3 (0.29 g/L NaCl, KCl, 13 mg/L 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0.48 g/L HEPES, pH 7.0, 살 균), 그리고 1의 8 mL 10ml 조직 배양 플라스 크로 x E3. 가볍게 소용돌이 22 ° c.에 저장 문화를 유지 하려면 2 주마다 10를 포함 하는 신선한 1 x E3 매체의 9 mL와 10 mL 조직 배양 플라스 크에 paramecia 문화의 1 mL 통로8 CFU/mL 대장균 MG1655 1에 resuspended의 x E3. 2. 세균성 복용량 Zebrafish에 관리의 결정 Paramecium 내에서 세균 반감기를 결정참고: 아래 설명 된 대로 paramecia 내의 박테리아의 반감기 도금 paramecium에서 복구 가능한 대장균 에 의해 결정 됩니다. 박테리아 (OD600 1.0) 22 ° C에서 paramecia와의 2 h 인큐베이션, 다음 paramecia와 50 mL 원뿔 튜브로 세균성 공동 문화를 결합, E3, 그리고 수 x 1와 paramecia 세척 (아래 단계에서 설명 하는 대로 밀리 리터 당 paramecia의 수 3.2.7 고 3.2.8)입니다. Paramecia의 수를 세 후 paramecia 및 세균성 공동 문화 (6 h 사후 노출)에 대 한 매시간 50 µ L을 제거 하 고 신선한 1.5 mL 튜브에 각 샘플을 추가 합니다. 1% 비 계면 활성 제의 장소 950 µ L ( 재료의 표참조) 인산 염에 버퍼링 (PBS) 염 1.5 mL 튜브와 1 분은 paramecia을 lyse 소용돌이의 각. 수행 하는 1시 10분 희석 액 (900 µ L 즉, 100 µ L)으로 살 균 PBS를 사용 하 여 각 샘플의 희석. 선택적 접시에 각 희석의 100 µ L 플레이트 (파운드 tet 매체: 30 µ g/mL 항생물질, 1 g/L NaCl, 0.5 g/L 효 모 추출 물, 1 g/L tryptone)와 16 h 37 ° C에서 품 어. 다음 날, 계산 하 고 계산만 분리 되 고 명료한 개인적인 식민지에 의해 접시 (콜로 니 형성 단위, CFUs)에 세균성 식민지의 수를 기록 합니다. 30-300 CFU 주는 희석으로 접시를 식별 합니다. 희석을 결정 요소 사용. 예를 들어 1 µ L 세균성 문화의 살 균 PBS의 99 mL와 혼합 하는 경우이 1: 100 (0.01) 희석입니다. 이 번호는 희석에서 CFU의 수 있을 것입니다. 원래 샘플의 CFU를 결정 하기 위해 모든 시간 지점에 대 한 아래, 계산을 수행: 계산 가능한 대장균수를 그래프/paramecium에 해당 하는 시간 노출 단계 3.3.1 계산 paramecia 농도 사용 하 여 게시 하 고 paramecia (그림 1) 내 반감기를 결정 합니다. CFU를 사용 하 여 계산 하 고 그래프의 paramecia 농도 단계 3.3.1에서에서 계산을 사용 하 여 x 축에 시간 게시물 보육 대 y paramecium 당 가능한 대장균 수 수 각 시간 지점에 대 한 계산. paramecia 내 반감기를 결정 합니다. 세균성 세균성 하프 라이프에서 투약 하 고 먹이 속도 결정 합니다.참고: 세균성 복용량을 결정 하는 paramecia 안에 박테리아의 반감기와 paramecia에 zebrafish의 먹이 비율 고려 되어야 해야 (단계 3.4 참조). 다음 수식을 사용 하 여 paramecia 내의 세균성 감퇴를 결정.(1)N0 paramecia 당 박테리아의 초기 수량 2 h 부 화 후가 Nt는 시간 t 후 나머지 수량, τ 후 실행 가능한 박테리아의 수는 절반으로, 시간 이며 k는 붕괴 상수. 저하 실험에서 붕괴 상수 k 세균 하프 라이프를 사용 하 여 결정 (즉, 시간 후 실행 가능한 박테리아/paramecium의 금액은 절반 가까이 떨어졌다).(2)하프 라이프의 결정에 대 한 용어 및(3) 또는(4)참고: 그림 1을 바탕으로, paramecia에 대장균 의 반감기는 약 2.3 h 이다. 따라서, 수식 (4), 감퇴 율, k를 사용 하 여, 대장균 은:(5) Zebrafish 애벌레에 의해 촬영 가능한 박테리아 (Nt)의 복용량을 찾을 반감기 실험에서 감퇴 율 (k)를 결정 후 먹이 시간 (t), (P)은 먹이 속도 또는 시간 당 한 물고기에 의해 먹 히는 paramecia의 수:(6) 또는(7)참고: 그림 1, 2 h 인큐베이션 (t) 후 paramecia (N0) 당 박테리아의 초기 수량 790 CFU입니다. 영화 1 과 그림 2, 먹이 속도 (P) 1539입니다. 이러한 값을 사용 하 여 방정식 (7)에, 다음으로 2 시간 보육 제 브라에서 세균성 복용량을 계산:(8) 3. 음식을 통한 감염 Zebrafish의 Paramecia와 박테리아를 품 어. Paramecia 및 대장균 MG1655의 공동 문화 감염 전에 밤을 준비 합니다. E3 미디어의 8 mL, 지속적인 paramecia 문화의 1 mL 및 대장균 MG1655 문화의 1 mL (OD600 = 1.0) 1에서 resuspended T25 조직 배양 플라스 크에 x E3. 하룻밤 실 온 (RT)에서 플라스 크를 품 어. 각 치료 상태에 대 한 paramecia의 2 개의 플라스 크를 준비 합니다. 세균성 성장 미디어 접종 (파운드: 1 g/L tryptone 0.5 g/L 효 모 추출 물, 1 g/L NaCl) 박테리아의 전염 성 긴장, 접시에서 개별 세균성 식민지를 선택 하 여 사용 하 여 살 균 접종 루프. 37 ° C에 액체 문화를 품 어 고 하룻밤 분 (rpm) 당 110 회전에서 흔들어 둡니다.참고: 개인 보호 장비 (실험실 코트와 장갑)을 착용 해야 하 고 전염 성 요원을 처리할 때 사용 해야 하는 biosafety 수준 2 시설. 다음 날, 하룻밤 문화의 OD600 을 측정 합니다. 문화 미디어의 11 ml에서 resuspended 때 1의 OD600 달성 하는 데 필요한 볼륨을 계산 합니다. Paramecia의 g 5 분, 각 플라스 크에 대 한 하나의 볼륨 x 6000에 원심 분리를 통해 단계 3.1.2에서에서 박테리아의 볼륨을 수확. 상쾌한 삭제 하 고 E3 미디어의 1 mL에서 세균 펠 릿 resuspend. 필요에 따라 사전에 형광 염료와 박테리아 얼룩. FM 4 64FX 세균성 얼룩 (5 mg/mL 재고 솔루션)의 1 µ L를 추가 합니다. 커버 호 일 photobleaching에서 보호 하 고 회전 이상 끝 RT에서 15 분 동안 품 어 튜브. 1 세척 하 여 과잉 염료를 제거 x E3: 작은 박테리아 원심 분리를 통해 6000 x g 1.5 분에서 다음 E3 미디어의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 두 번 세척 단계를 반복 합니다. 수확 스테인드 박테리아 원심 분리를 통해 6000 x g 5 분 삭제에는 상쾌한 고 E3 미디어의 1 mL에서 세균 펠 릿 resuspend. 신선한 paramecia의 두 개의 플라스 크의 각 세균 정지의 1 mL를 추가 합니다. 2 h RT에서 품 어.참고: 얼룩진된 박테리아를 사용 하는 경우 2 시간에 대 한 실시간에 어둠 속에서 품 어. 워시 박테리아/paramecia 공동 문화입니다. 50 mL 원뿔 튜브에 paramecia/박테리아 공동 문화의 두 플라스 크의 내용을 결합 합니다. 10 분에 대 한 15 ° C에서 300 x g 에서 원심 분리기 샘플은 원심이이 단계 전에 미리 냉각 있는지 확인 합니다. E3 상쾌한 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여의 약 10 mL을 제거 하 고 신선한 1의 약 10 mL를 추가할 원뿔 튜브에 x E3.참고: 모든 세척 단계 동안 되려고 매우 빠른 상쾌한, 제거는 paramecia 펠 릿에서 수영 하기 시작 것입니다 필수적입니다. 회전 하 고이 단계에서 충분 한 빠른 처리를 위해 한 번에 하나의 튜브에서 상쾌한 제거는 상쾌한에 paramecia의 손실을 방지. 5 분 약 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 e 3 상쾌한의 제거에 대 한 샘플 원심 분리를 통해 15 ° C에서 300 x g에서 회전 하 고 신선한 1의 약 10 mL를 추가할 원뿔 튜브에 x E3. 이 단계를 두 번 반복 합니다. 5 분에 대 한 15 ° C에서 300 x g 에서 원심 분리기 샘플 약 10 mL는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 E3 상쾌한의 제거. E3 미디어의 나머지 10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 관으로 현 탁 액의 500 µ L를 전송. Paramecia의 수를 계산 하는 5 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuging에 의해 paramecia의 500 µ L를 작은. 500 µ L 샘플에서 표면에 뜨는 E3의 400 µ L을 제거 합니다. Paramecia의 나머지 100 µ L를 36.5% 포름알데히드 용액의 20 µ L을 추가 하 고 부드럽게 resuspend, 및 22 ° c.에 5 분 동안 품 어참고: 이 단계는 세 수 있도록 paramecia를 죽인다. 피 펫 및 레코드를 사용 하 여 실제 총 볼륨을 측정 합니다. Paramecia 서 스 펜 션 1:1 v/v 0.4 %trypan 블루 솔루션을 희석. 사용 하 여 셀 또는 hemocytometer 죽은 paramecia/mL의 수를 계산 하.참고: 사전 정착 단계 때문에 대부분 paramecia 죽은 시점에서, 하지만이 숫자는 라이브 paramecia 공동 배양 실험에 대 한 수를 반영. 저자가 여기 요인으로 무시 될 수 있다 그래서 세균성 공동 화, 때문에 중요 한 paramecia 죽음을 발견 하지 않았습니다. 공동 Paramecia 그리고 zebrafish 애벌레를 품 어. Paramecia의 농도 계산.참고: 이 계산 단계의 3.2.5 50 mL 원뿔 튜브에 paramecia의 농도 제공합니다. E 3의 3 mL의 최종 볼륨에서 2 x 105 paramecia/mL의 농도에 필요한 세척된 paramecia의 볼륨을 계산 합니다.참고: Paramecia의 농도 최적화는 원하는 세균성 복용량에 따라 조정할 수 있습니다. 제 브라 paramecia (계산 단계에서의 적절 한 농도 포함 하는 신선한 E3의 3 mL의 총 볼륨으로 6 잘 플레이트의 각 음에 100 mg/l. 전송 10 zebrafish의 최종 농도를 100 mM Tris pH 8.0에서에서 tricaine를 추가 하 여 anesthetize 3.3.2). 그들은 받는 사람 잘 마 취에서 회복 되도록 액체의 최소한에 애벌레를 전송 확인. 먹이 대 한 최적의 번개 조건 되도록 하루 빛 조건에서 일주 인큐베이터에 2 h 30 ° C에서 품 어. 워시 zebrafish 전송 물고기는 새로운 잘 포함 3 mL 신선한 E3 때마다 100 mg/L tricaine를 포함 하 여 5 회 이상.참고: 세척 단계는 tricaine를 생략 하지 마십시오. 마 취 없이 모바일 애벌레 전송 손상 동물 조 난의 위험이 증가 합니다. 선택적으로, 준비 zebrafish 이미징 블랙 벽 6 잘 플레이트에서 1% 낮은 용융 agarose의 3 ml에서 zebrafish를 포함 하 여: 낮은 용융 agarose 1xE3에서 구성 하 고 전자 레인지에서가 열. 일단 녹은, 160 mg/mL의 최종 농도에 tricaine를 추가 합니다. 잘린된 젤 팁, 머리는 왼쪽 꼬리에가 로드를 사용 하는 stereomicroscope에서 위치 생선은 오른쪽 (그림 3). Agarose 설정 하려면 5 분 기다립니다 다음 이미징 1 x E3 포함 160 mg/mL tricaine와 함께 포함 된 물고기를 오버레이 합니다. 먹이 속도 결정 합니다.참고: 아니 별도 실험 먹이 속도 결정 하도록 설정 해야 합니다. 오히려,이 해질 수 있다 단계 3.3.4, 아래 설명 된 대로. 3.3.4 단계 먹이 zebrafish 먹이 캡처의 stereomicroscope 및 캡처 영상 볼. 점수는 영상. 먹이 캡처 먹이 향해 zebrafish의 눈에 띄는 특징 이다. 비록이 단지 근사 각 공격 한 먹이 캡처 이벤트로 계산 ( 내용참조). 각각 다른 zebrafish 애벌레 (그림 2)을 나타내는 여러 개의 비디오 클립에서 시간 당 먹이 캡처 이벤트의 평균 개수를 계산 합니다.