Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling <em>via</em> the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Elijah W. Chen; Chyan Ying Ke; Joanna Brzostek; Nicholas R. J. Gascoigne; Vasily Rybakin

doi:10.3791/58946

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Inmunología y contagio

Identifiering av mediatorer av T-cells Receptor signalering via Screening av kemiska hämmare bibliotek

Published: January 22, 2019

doi:

10.3791/58946

Elijah W. Chen*¹, Chyan Ying Ke*^2,3, Joanna Brzostek*¹, Nicholas R. J. Gascoigne¹, Vasily Rybakin^1,4

¹Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine,National University of Singapore, ²Singapore Immunology Network,A*STAR, ³Curiox Biosystems, ⁴Department of Immunobiology, Rega Institute for Medical Research,Katholieke Universiteit (KU) Leuven

Summary

Detta dokument använder en flow-flödescytometri-baserad analys till skärmen bibliotek av kemiska hämmare för identifiering av hämmare och sina mål som påverkar T-cells receptor signalering. Metoderna som beskrivs här kan också utökas för hög genomströmning filmvisningar.

Abstract

T-cell receptorn (TCR) signaling pathway består av en mängd medlare som överför signaler vid aktivering av TCR. Olika strategier har föreslagit och genomförts för identifiering av nya mediatorer av TCR signalering, vilket skulle förbättra förståelsen av T-cell processer, inklusive aktivering och thymic urval. Vi beskriver ett screening-test som möjliggör identifiering av molekyler som påverkar TCR signalering baserat på aktivering av utveckla tymocyter. Stark TCR signaler orsaka utveckla tymocyter att aktivera apoptotiska maskiner i en process som kallas negativa urval. Genom tillämpning av kinashämmare kan de med mål som påverkar TCR signalering åsidosätta negativa urvalsprocessen. Den metod som beskrivs i detta dokument kan användas för att identifiera hämmare av kanoniska kinaser med etablerade roller i de TCR signalvägar och också hämmare av nya kinaser ännu skall fastställas i signalvägar som TCR. Screening strategin här kan tillämpas på skärmar av högre genomströmning för identifiering av Roman druggable mål i TCR signalering.

Introduction

T-celler är en utvecklingslinje av lymfocyter som spelar en central roll i upprätthållandet av adaptiv immunitet. De uttrycker TCR, vilket gör dem att känna igen deras ligander, komplex som består av en större histocompatibility komplex molekyl (MHC) med en bunden peptid, som återfinns på ytbehandlar av antigen-presenterande celler (APC). Utlösning av TCR signalering väg genom den TCR/MHC samverkan är avgörande för T-cells aktivering och utveckling¹.

I T-cells utveckling migrera ben-märg-härrör hematopoetiska stamceller (Förenta) till tymus, där de genomgår differentiering och gå igenom stadier av T-cell lineage progression². Dubbel-positiv (DP) tymocyter, uttrycker både CD4 och CD8 coreceptors, delta med self-peptid/MHC på trupptransportfordon. Tymocyter med en måttlig affinitet för deras själv-peptid/MHC ligander mogen för att bli singel-positiv (SP) CD4 eller CD8 tymocyter, en process som kallas positiva urval. Omvänt, tymocyter som får överdriven TCR stimulering genom de self-peptid/MHCs genomgå apoptos via negativa urval³^,⁴. Denna process av stimulering-inducerad, kaspas-beroende apoptos kan vara härmade i vitro genom att stimulera tymocyter, till exempel med anti-CD3/28 antikroppsbelagda pärlor⁵. Mogna T-celler som klarar urvalsprocessen aktiveras av icke-jaget-peptid/MHC ligander från trupptransportfordon i periferin. Self-peptid/MHCs är fortfarande relevanta för perifera T-celler, i samband med tonic signalering för överlevnad och homeostatiska proliferation, differentiering av helper T-celler och förbättrande av T-cell svar på icke-själv-peptid/MHCs genom coagonism⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Hög affinitet TCR bindning till peptid/MHC liganden aktiverar flera nedströms signalvägar, som inbegriper många signalmolekyler som bildar en komplexa TCR signalering nätverk¹⁰. Signalvägar som TCR har studerats i flera decennier, och ändå upptäckten av nya mediatorer av väg visar inga tecken på att avta¹¹^,¹². Moduleringen av TCR signalvägar har klinisk relevans och kan involvera potentierande T-cell svar för immunoterapeutisk program eller hämning av T-cell svar för kontroll av autoimmunitet¹³. Strategier för moduleringen av T-cell svar bero huvudsakligen på störningar av Kinas eller fosfatas aktivitet¹⁴^,¹⁵^,¹⁶.

Vi beskriver en ansökan av en flow-flödescytometri-baserad analys för screening av små kemiska föreningar för sin förmåga att modulera TCR signalering och T-cells aktivering¹⁷. Analysen handlar om fenomen av tymocyter aktivera apoptos vägen när de utsätts för starka TCR signaler. Analysen är tillräckligt känslig för att identifiera ändringar i stimulering styrka; ruvning tymocyter uttrycker transgena TCR med peptid/MHC tetramers med ökande affinitet resulterade i en motsvarande ökning av kaspas aktivering-används som ett mått på den apoptotiska svar⁵. För skärmen, vi använde ett bibliotek av kinashämmare och bedömt deras förmåga att modulera thymocyte svaret på starka TCR signaler.

Flera flöde-flödescytometri- eller fluorescens-reporter-baserade strategier har beskrivits för high-throughput screening av ett sortiment av perifera aktiveringen fenotyper i olika T-cell delmängder. Sådana strategier inkluderar användning av genetiska fluorescerande reportrar att bedöma tidpunkten och omfattningen av T-cells aktivering¹⁸, användning av degranulering som en avläsning av cytotoxiska T-cells aktivitet¹⁹^,²⁰, och analysen av den fosforylering av olika proteiner involverade i cellulär signalering²¹.

Den screening-test som presenteras här är kunna framgångsrikt identifiera substanser som hämmar kanoniska molekyler av TCR signalering utbildningsavsnitt, liksom potentiella, roman föreningar med hämmande effekt på TCR signalering. Exempelvis har vi identifierat hämmare av GSK3β och Hsp90 som nya föreningar som påverkar T-cell svar¹⁷. Analysen är kunna skilja de hämmare som störa signaltransduktion, på grund av en minskning i apoptotiska svaret från TCR-oberoende effekter av hämmare på cellulär toxicitet. Förutom induktion av apoptos mäta vi också CD69 uppreglering och TCR nedreglering som markörer för aktivering. Som TCR signalering nätverk är komplexa, kan användning av flera utläsningar öka chanserna att upptäcka molekyler med specifika effekter på en enskild väg. Här, införa vi också användning av ett centrifugering-oberoende protokoll som en hög genomströmning alternativ till den ursprungliga protokollet under färgningen av cellerna i förberedelse för flöde flödescytometrisk analys. Den analysmetod som beskrivs i detta dokument använder en liten förening bibliotek av kinashämmare men, i princip, den kan användas för högre genomströmning screening. Biblioteket i val kan också innehålla en mängd-hämmare eller andra molekyler.

Protocol

6 – 8 vecka-gamla manliga och kvinnliga C57Bl/6 möss användes i denna studie. Mössen var uppvuxna i djuranläggningen vid National University of Singapore (Singapore). National University of Singapore institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) godkände alla djurförsök. 1. beredning av Thymocyte Suspension Euthanize mössen i en CO2 kammare. Utför följande steg i vävnadsodling huva att undvika kontaminering av cellkulturer. Säkra mus kadaver dissekering styrelsen, använda pins, och spraya musen med 70% etanol. Använda ett par sax, göra ett vertikalt snitt på ventrala sida, start från buken mot käken. Göra ytterligare snitt längs varje av bakbenen. Sträck ut huden för att exponera bröstkorgen och fästa den. Skär membranet och båda sidor av bröstkorgen från den bakre änden med en sax. Lyft bröstkorgen och fästa den ner till exponera tymus. Separat bindväv bifogas bräss och extrahera bräss använder ett par böjda pincetten. Placera bräss i en väl 6-well platta innehållande 5 mL komplett RPMI media.Överväg att lägga till 10% träkol-skrapat fetalt bovint serum (FBS) i media för att förbättra thymocyte lönsamhet om en lång väntetid förväntas mellan dissektion och stimulering analysen. Försiktigt mosa tymus, med den trubbiga änden av en spruta, och passera cellerna genom en sil med 70 µM i cellen. Alternativt, samla in tymocyter i friskare skick, överväga att använda två par pincett att pressa bräss och samla tymocyter det flöden av thymic epitel. Gå vidare till cell räkna, med en hemocytometer eller en automatiserad cell räknar instrumentet. 2. titrering av kinashämmare giftfritt koncentrationer Obs: Detta avsnitt fokuserar på att förbereda hämmare för användning i T-cells aktivering skärmarna. -Hämmare som används vid höga koncentrationer kan orsaka celldöd, vilket är en avläsning av T-cells aktivering skärmarna. Serien av spädningar av hämmare syftar till att fastställa den slutliga koncentrationen av de enskilda hämmare som inte bör inducerar apoptos oberoende av TCR stimulering. Biblioteket av kinashämmare som används i denna studie köptes från en extern leverantör. Listan över hämmare ingår i Tabell för material. Beredning av plattor av kinashämmare vid lägre koncentrationer För att förbereda en tallrik hämmare på 1 mM, tillsätt 10 µL av hämmare till 90 µL av dimetyl sulfoxid (DMSO) för alla-hämmare.Obs: Hämmare från småmolekylär biblioteket som används i denna studie kommer ett lager koncentration av 10 mM. Om hämmare i pellets form, följ Rekommenderad beredning stegen från leverantörer. Om hämmare inte tillhandahålls på 10 mM, förbereda hämmare plattorna vid alternativa lämpliga koncentrationer istället och förbereda separat seriespädningar av hämmare med en lämplig utspädningsfaktor.Varning: I fall av giftiga hämmare, följ tillverkarens instruktioner för säker hantering och kassering. För att förbereda en tallrik hämmare på 0,1 mM, Lägg till 10 µL av hämmare från plattan av 1 mM-hämmare till 90 µL av DMSO. För att förbereda en tallrik hämmare på 0,01 mM, Lägg till 10 µL av hämmare från plattan av 0,1 mM-hämmare till 90 µL av DMSO. Behandling av tymocyter med kinashämmare Förbereda en thymocyte suspension enligt avsnitt 1. Späd tymocyter i komplett RPMI att erhålla en thymocyte suspension 5 x 106 celler/ml. Tillsätt 200 µL thymocyte suspension till alla brunnar i en plattan med 96 brunnar, med hjälp av en flerkanalspipett. I varje brunn, tillsätt 2 µL av hämmare från motsvarande väl av plattan innehåller 1 mM-hämmare (hämmare slutliga koncentration är 10 µM). I samma platta, förbereda fyra brunnar i obehandlade kontroller, fyra brunnar av 5 µM dexametasonbehandlade positiva kontroller och fyra brunnar i fordonet-behandlade negativa kontroller, genom att lägga till 2 µL av DMSO. Inkubera i tymocyter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 17-20 h (eller över natten). Bestämning av lämplig koncentration av enskilda hämmare Snurra plätera av tymocyter vid 300 x g och 4 ° C, för 5 min. resuspendera cellerna i 250 µL FACS tvättbuffert. Kör en flöde flödescytometrisk analys av proverna och analysera resultaten med en flöde flödescytometri analysprogram. Bestämma procentandelen av levande celler baserat på FSC-SSC gating. Usenets strategin visas i figur 1B. Beräkna procentandelen av levande celler baserat på DMSO-behandlade kontrollerna, som är normaliserade till 100% i genomsnitt. Ställ in en godtycklig fönster godtagbar celldöd (e.g.,20%). Hämmare som resulterade i en procentandel av levande celler nedanför fönstret (dvs., under 80% av DMSO-behandlade kontrollerna) kommer att testas igen vid lägre koncentrationer. För de hämmare som inte klarade lönsamhetskriterierna i steg 2.3.4, upprepa steg från trappan 2.2.1 – 2.3.4, men använda plattan-hämmare på 0,1 mM steg 2.2.4 i stället för plattan innehåller de 1 mM-hämmare. Den slutliga koncentrationen av-hämmare som används här är 1 µM. För de hämmare som fortfarande producera höga nivåer av celldöd vid 1 µM, testa hämmare på 0.1 µM. Upprepa steg 2.2.1 – 2.3.4, men använda plattan-hämmare på 0,01 mM i steg 2.2.4. Den slutliga koncentrationen av-hämmare som används här är 0.1 µM. Förberedelse av ett lager platta av kinashämmare För-hämmare ska användas vid 10 µM, Lägg till 10 µL 10 mM-hämmare till 10 µL av DMSO. För-hämmare ska användas vid 1 µM, tillsätt 1 µL 10 mM-hämmare i 19 µL av DMSO. För-hämmare ska användas vid 0.1 µM, lägga till 1 µL 10 mM-hämmare i 199 µL av DMSO (figur 1 c).Obs: Beredda stock plätera av hämmare är 500 x koncentrationen av avsedda slutliga koncentration när läggas till de thymocyte suspensioner. Beståndet plätera av hämmare kan förberedas PCR remsor eller i 96 brunnar. Beståndet plätera av kinashämmare kan tillämpas på tymocyter för screening i ett konventionellt centrifugering-beroende system (avsnitt 3; se figur 1A, metoderna 1 och 2) eller i ett alternativt centrifugering-oberoende system (avsnitt 4; se Figur 1A, metod 3). 3. kinase Inhibitor bibliotek Screening (konventionella centrifug-baserad analys) Behandling av tymocyter med kinashämmare Förbereda en thymocyte suspension enligt avsnitt 1. Späd tymocyter i komplett RPMI att erhålla en thymocyte suspension 5 x 106 celler/ml. Tillsätt 200 µL av tymocyter till varje brunn en plattan med 96 brunnar, med hjälp av en flerkanalspipett. Placera plattan på is. Lägg till 0,5 µL av hämmare till plattan med 96 brunnar från motsvarande brunnarna lager Skyltens hämmare beredd i avsnitt 2.4. Förbered åtta brunnar i obehandlade kontroller. Förbereda fyra brunnar i fordonet-behandlade kontrollerna genom att lägga till 0,5 µL av DMSO. Förbereda fyra brunnar av 5 µM dexametasonbehandlade kontroller (figur 2). Stimulering av tymocyter använder anti-CD3/CD28 pärlor Ta 1 mL av pärlor och tvätta pärlorna med 2 mL PBS. Separera pärlorna med hjälp av en magnetisk stå och aspirera lösningen. Återsuspendera pärlorna i 5 mL komplett RPMI.Obs: Förhållandet mellan pärlor till celler är 1 till 2,5. Justera mängden pärlor att ta, beroende på antalet brunnar att stimulera och antalet tymocyter används. Tillsätt 50 µL pärlor i varje hämmare-behandlade prov, de fyra DMSO-behandlade proverna och fyra av de åtta obehandlad proverna. Tillsätt 50 µL komplett RPMI i de återstående fyra obehandlade brunnarna. Figur 2 visar den allmänna layouten för plattan. Blanda innehållet i brunnarna med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera i tymocyter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 17-20 h (eller över natten). Färgning av ytantigener Förbereda en antikropp färgning blandning som innehåller anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 och anti-CD69 antikroppar. Späd antikroppar i FACS tvättbuffert (PBS kompletteras med 0,5% bovint serumalbumin [BSA]) i förhållandet 1: 200 (v/v).Överväg att optimera antikroppsnivåerna var används för färgningen, istället för att använda fasta antikropp utspädningar, att minimera variationen i färgning över olika experiment och att förbättra signal-brus-förhållandet. Snurra på plattan på 300 x g och 4 ° C, för 5 min. Svep på plattan för att kassera lösningen. Vid denna punkt, protokollet kan följa protokollet konventionella centrifug-beroende (gå vidare till steg 3.3.5; Se figur 1A, metod 1) eller alternativa centrifugering-oberoende protokollet (gå vidare till steg 4.4.4; se figur 1A, metod (2). Att resuspendera cellerna i 75 µL färgning antikropp blandningen bereddes i steg 3.3.1. Blanda proverna med hjälp av en flerkanalspipett och inkubera dem på is i 30 min. Fixering av celler Tvätta brunnarna med 200 µL FACS tvättbuffert och snurra plattan på 300 x g – och 4 ° C, för 5 min. Svep på plattan för att kassera lösningen. Lägg till fixering/permeabilisering buffert (kommer med aktiv kaspas-3 apoptos kit; samma med 10 x perm/tvättbuffert nämns i steg 3.5.1 och anti-kaspas-3 antikroppen i steg 3.5.2) på 200 µL per brunn. Inkubera i isen i 30 min. Intracellulära färgning för aktiva kaspas 3 Laga 1 x perm/tvättbuffert genom att späda ut 5 mL 10 x perm/tvättbuffert i 45 mL ultrarent vatten. Förbereda intracellulära aktiva kaspas fläcken genom att lägga till 1,3 mL anti-kaspas-3 antikropp 6,5 mL 1 x perm/tvättbuffert. Förhållandet av antikropp till perm/tvätt buffert är 1:5. Snurra på plattan på 300 x g och 4 ° C, för 5 min. Flick plattan att kassera lösningen. Tvätta plattan med 200 µL 1 x perm/tvättbuffert. Upprepa steg 3.5.3. Snurra på plattan på 300 x g och 4 ° C, för 5 min. Flick plattan att kassera lösningen. Tillsätt 75 µL av intracellulära kaspas fläcken bereddes i steg 3.5.2 i alla brunnar. Blanda proverna med hjälp av en flerkanalspipett och inkubera på is för 1 h. Tvätta av prov med 200 µL 1 x perm/tvättbuffert och snurra plattan på 300 x g och 4 ° C, för 5 min. Svep på plattan för att kassera lösningen. Tvätta plattan med 200 µL 1 x perm/tvättbuffert. Snurra på plattan på 300 x g och 4 ° C, för 5 min. Svep på plattan för att kasta lösningen och återsuspendera proverna i 200 µL FACS tvättbuffert. Kör en flöde flödescytometrisk analys av proverna och analysera resultaten med en FACS analysprogram. Använder en CD4 och CD8 tomt, gate på DP tymocyter befolkning med ett positivt uttryck för både CD4 och CD8 (figur 2, nedre halvan). Inom DP thymocyte porten, bestämma procentandelen av celler med aktiverade kaspas-3, med ostimulerade provet som negativ kontroll och dexametason som positiv kontroll. För analys av uttryck för CD69 i utfärda utegångsförbud för DP-thymocyte, använda ostimulerade provet som den negativa kontrollen och stimulerad provet som positiv kontroll.Obs: När gating på de DP tymocyter, kontrollera att befolkningen i DP tymocyter är gated korrekt för enskilda prover. Stimuleras cellerna downregulate ytan coreceptors och en oavsiktlig uteslutande av händelser kan uppstå om en tight DP-porten används. 4. kinase Inhibitor bibliotek Screening (centrifug-oberoende analys) Behandling av tymocyter med kinashämmare Förbereda en thymocyte suspension enligt avsnitt 1. Späd tymocyter i komplett RPMI att erhålla en thymocyte suspension 25 x 106 celler/ml. Tillsätt 40 µL av tymocyter till varje brunn små volymer platta, med hjälp av en flerkanalspipett. Placera plattan på is. Späd hämmare från lager platta, DMSO och dexametason i komplett RPMI i fyra delar av komplett RPMI förhållandet till en del av hämmare/DMSO/dexametason (utspädningsfaktor 5).Obs: Eftersom de volymer som används i denna små volymer platta 5 x mindre än i den konventionella metoden, hämmare och kontroll Reagenserna skall spädas ut fivefold innan de läggs till i tymocyter i plattan. Tillsätt 0,5 µL av hämmare till plattan med 96 brunnar från motsvarande brunnarna Skyltens hämmare bereddes i steg 4.1.4. Förbered åtta brunnar i obehandlade kontroller. Förbereda fyra brunnar i fordonet-behandlade kontrollerna genom att lägga till 0,5 µL av den DMSO som bereddes i steg 4.1.4. Förbereda fyra brunnar av 5 µM dexametasonbehandlade kontroller, använda den utspädda dexametason som bereddes i steg 4.1.4 (figur 2). Stimulering av tymocyter använder anti-CD3/CD28 pärlor Kontrollera att pärlorna är enhetligt resuspended. Ta 1 mL av pärlor och tvätta dem med 2 mL PBS. Separera pärlorna med hjälp av en magnetisk stå och aspirera lösningen. Återsuspendera pärlorna i 1 mL av komplett RPMI.Obs: Förhållandet mellan pärlor till celler är 1 till 2,5. Justera mängden pärlor, beroende på antalet brunnar att stimulera och antalet tymocyter används. Tillsätt 10 µL pärla suspension varje hämmare-behandlade prov, de fyra DMSO-behandlade proverna och fyra av de åtta obehandlad proverna. Tillsätt 10 µL av komplett RPMI till resterande fyra obehandlade brunnarna. Figur 2 visar layouten allmänna plattan.Obs: Sista volymen av brunnarna är 50 µL, som ligger inom den maximala kapaciteten av brunnarna. Det är viktigt att vara försiktig och hålla plattorna upprätt, att undvika cross-väl spill. För att blanda, skaka plattan orbital skakapparat mikroplattan. Du kan också blanda innehållet i brunnarna med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera i tymocyter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 17-20 h (eller över natten) med anti avdunstning lock. Inställning av plattan brickanObs: Instruktionerna för att ställa in plattan brickan tillhandahålls av tillverkaren. Stegen nämns i korthet nedan. För varje priming steg behövs ungefär 150 mL lösning. Prime Tvättsystemet med 70% etanol innehållande 1% Tween-20. Prime Tvättsystemet med avjoniserat vatten innehållande 1% Tween-20. Prime Tvättsystemet med FACS tvättbuffert. Färgning av ytantigener Förbereda en antikropp färgning blandning som innehåller anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 och anti-CD69 antikroppar. Späd antikropparna i FACS tvättbuffert i förhållandet 1: 100 (v/v). Tvätta plattan 9 x, med 55 µL FACS tvättbuffert per tvätt, med hjälp av den automatiska laminärt flöde tvättsystem.Obs: I slutet av tvättarna, det blir 25 µL av resterande volym i varje brunn. Att resuspendera cellerna i 25 µL av färgning antikropp blandningen bereddes i steg 4.4.1. Om proverna överförs från en plattan med 96 brunnar (från steg 3.3.4), resuspendera cellerna i 50 µL av antikropp blandningen bereddes i steg 3.3.1 och överför proverna till små volymer plattan. Detta steg motsvarar metod nummer 2, som avbildas i figur 1A. Att blanda, skaka plattan med en mikroplattan orbital shaker eller blanda proverna med hjälp av en flerkanalspipett och inkubera på is i 30 min. Fixering av celler Tvätta plattan 9 x, med 55 µL FACS tvättbuffert per tvätt, med hjälp av den automatiska laminärt flöde tvättsystem. Lägg till fixering/permeabilisering buffert (kommer med aktiv kaspas-3 apoptos kit; samma med 10 x perm/tvättbuffert nämns i steg 4.6.1 och anti-kaspas-3 antikroppen i steg 4.6.2) på 50 µL per brunn. Inkubera i isen i 30 min. Intracellulära färgning för aktiva kaspas 3 Laga 1 x perm/tvättbuffert genom att späda ut 25 mL 10 x perm/tvättbuffert i 225 mL av ultrarent vatten. Förbereda intracellulära aktiva kaspas fläcken genom att tillsätta 1 mL anti-kaspas-3 antikropp i 2 mL 1 x perm/tvättbuffert. Förhållandet av antikropp till perm/tvätt buffert är 1:2. Prime Tvättsystemet med 1 x perm/tvättbuffert. Tvätta plattan 9 x med 1 x perm/tvättbuffert, på 55 µL för varje tvätt. Tillsätt 25 µL av intracellulära kaspas fläcken bereddes i steg 4.6.2 i alla brunnar. Att blanda, skaka plattan med en mikroplattan orbital shaker eller blanda proverna med hjälp av en flerkanalspipett och inkubera på is för 1 h. Tvätta plattan 9 x med 1 x perm/tvättbuffert, på 55 µL för varje tvätt. Tillsätt 25 µL FACS tvättbuffert i alla brunnar. Överföra proverna till mikrotiter rören efter adekvat blandning via pipettering. Lägga till en annan 50 µL FACS tvättbuffert i tomma brunnarna och upprepa steg 4.6.9. Upprepa steg 4.6.9 och 4.6.10 Hämta 2 x tills 200 µL av proverna samlas i mikrotiter rören.Obs: Syftet med de förfaranden som beskrivs i steg 4.6.10 Hämta och 4.6.11 är att säkerställa en maximal återhämtning av celler från små volymer plattan. Om cell nummer är inte ett problem, efter steg 4.6.10 Hämta, helt enkelt fylla i mikrotiter-rör till 200 µL med FACS tvättbuffert. Kör en flöde flödescytometrisk analys av proverna och analysera resultaten med en FACS analysprogram, enligt steg 3.5.11. Kaspas-3 aktivering och CD69 uttryck analyseras i utfärda utegångsförbud för som innehåller CD4+CD8+DP tymocyter.

Representative Results

Metoden att screening analysen sammanfattas i figur 1A. Kinashämmare screenades först för sin latenta effekter på thymocyte lönsamhet. Som positiv kontroll för apoptos användes dexametason som proapoptotiska agent. Den gating för levande cell befolkningen bestämdes utifrån de obehandlade negativa kontrollerna och de dexametasonbehandlade positiva kontrollerna (figur 1B). Hämmare prövades först vid 10 µM på tymocyter, och procentandelen av viabla celler mättes efter inkubation för 18 h. Ett 20% fönster för celldöd valdes så att föreningarna som induceras en större än 20% förlust av celler i den levande cellen gate, jämfört med DMSO-behandlade proverna, testades vid lägre koncentrationer (figur 1B). Representativa FACS tomter av valda hämmare-behandlade prover visas att illustrera lönsamhet analysen. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), en PI3K hämmare22, inte kraftigt ökade celldöd vid 10 µM och hämmaren användes vid 10 µM för de efterföljande analyserna. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), en dubbla hämmare av PI3Kα/mTOR23, inducerad celldöd vid 10 µM hög och vid 1 µM men 0,1 µM och 0,1 µM fastställdes vara lämpliga koncentrationen för tillämpning i nedströms analyser. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3′,2′,1′-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS-62996-74-1), en pan-C proteinkinashämmare med en etablerad förmåga att inducera apoptos24, inducerad betydande celldöd vid alla koncentrationer testats, även vid 0.1 µM. Det användes i efterföljande analyser vid 0.1 µM som en extra positiv kontroll. De slutliga koncentrationerna av hämmare valdes ut baserat på de högsta koncentrationerna vari de inte förstärka celldöd av mer än 20% av DMSO-behandlade proverna. Med slutliga koncentrationerna av de hämmare fastställs, förbereddes en lager platta av hämmare så att alla hämmare 500 gånger koncentrationen när det appliceras på cellerna. Figur 1 c visar plattan layout lager plattan, med de slutliga koncentrationerna av hämmare. I alternativa protokoll ruvning cellerna direkt i små volymer plattorna för den laminärt flöde tvätt assay, nödvändiggjorde användningen av små volymer en ytterligare spädning av de-hämmare. För att säkerställa att DMSO innehållet av kulturerna efter hämmare tillägg inte skulle vara för hög för cellerna, hämmare var ytterligare utspädd i komplett RPMI, genom en utspädningsfaktor på 5, så att de var på 100 gånger den planerade koncentrationen när de tillämpas på den celler. De hämmare, utspätt till giftfritt koncentrationer, användes i analysen för TCR-stimulering-inducerad apoptos i tymocyter5,17. Stimuleringen utfördes med anti-CD3/CD28 pärlor för 18 h, och cellerna var därefter färgas för kaspas-3 aktivering i CD4+ och CD8+ DP thymocyte befolkningen (figur 2). En ökning av kaspas-3 aktivering och CD69 uttryck, och också en TCR nedreglering, observerades hos både det anti-CD3/CD28-stimulerat och DMSO-mock-behandlade anti-CD3/28-stimulerad proverna, jämfört med de nonstimulated proverna. Dexametasonbehandlade proverna visade en ökning i kaspas-3 aktiveringen oberoende av CD69 uppreglering, som förväntas av apoptos-inducerande effekten är oberoende av TCR stimulering. Figur 3A sammanfattar resultaten av biblioteket screening test för valda hämmare. Både kaspas-3 aktivering och CD69 kan användas för att identifiera potentiella inhibitorer av intresse på grund av dämpningen av uttryck. Som förväntat, dök hämmare av kanoniska mediatorer av TCR signalering upp som positiva träffar i skärmarna. Sådan-hämmare, som visat varierande grad av hämmande potens, ingår ett bredspektrigt hämmare som riktar flera kinaser och även mer specifika hämmare. Vissa hämmare kunde undertrycka både kaspas-3 aktivering och CD69 uppreglering (figur 3B, översta raden, vänstra paneler). En sådan hämmare är bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), som hämmar alla protein kinase C isoformer, förutom proteinkinas A och PDK125,26,27. En annan hämmare i denna kategori är CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; (CAS 494772-86-0), en föreslagna hämmare av IKK228. Det var föreningar som hämmade CD69 uppreglering men inte försämrar kaspas-3 aktivering (figur 3B, översta raden, rätt paneler). CAY10626, en hämmare av PI3Kα och mTOR23, och U-0126 (2,3-bis [amino [(2-aminophenyl) thio] metylen]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), en MEK hämmare29, var några av de identifierade hämmare. Resultaten visar att olika hämmare inriktning olika kinaser från särskilda grenar av den TCR signalvägen, särskilt de inriktning sent stadium kinaser, kan resultera i selektiv nedskrivning av T-cells aktivering fenomen. Det fanns också hämmare som inte undertrycka både CD69 uppreglering och kaspas-3 aktivering (figur 3B, nedersta raden, vänster paneler). Paklitaxel (βS-(benzoylamino) – αR – hydroxy-benzenepropanoic syra, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester; CAS 33069-62-4), en disruptor mikrotubulära dynamics30och necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS-337349-54-9), en hämmare av RIP1 kinase31, är två hämmare identifieras för att vara i denna kategori. I sådana fall där CD69 uppreglering och kaspas-3 aktivering inte var nedsatt, kan detta på grund av hämmare inte inriktning en relevanta Kinas av TCR signalering utbildningsavsnitt. Som tidigare nämnts användes staurosporine i skärmarna, i en koncentration som fortfarande inducerad apoptos i tymocyter. Som förväntat, staurosporine-behandlade provet visade höga halter av kaspas-3 aktivering (figur 3B, nedersta raden, högra kolumnen). De låga nivåerna av CD69 uttryck kan hänföras till staurosporine-medierad hämning av PKC, som bisindolylmaleimide II, en annan pan-PKC-hämmare, undertryckta också uttrycket av CD69. Alternativt inducerad staurosporine apoptos i celler innan de kunde upregulate CD69 uttrycket. För att öka genomströmningen och automatisering av protokollet, utarbetades parallellt protokoll som inneburit att användningen av en automatiserad platta tvätt system via laminärt flöde. Två separata protokoll använder denna automatiserade plattan tvätt enhet var trialed och jämfört med den konventionella metoden för odling av celler i 96 brunnar och färgning cellerna i ett protokoll som centrifugering-beroende. En metod inblandade odla cellerna i 96 brunnar, enligt standardförfarande, och sedan överföra cellerna till plattor som är kompatibel med automatiserade tallrik bricka för färgningen steg (figur 4, DA-tvätt prover). Den andra metoden innebar odla cellerna direkt i plattan-bricka-kompatibel plattorna och fortsätter med protokollet färgning på samma platta (figur 4, DA-kultur prover). Centrifugering-oberoende protokollen ger inte många uppfattbar skillnader i aktiva kaspas-3, CD69 eller TCRβ färgning över de olika prover testas, jämfört med konventionella centrifugering-beroende protokollet (figur 4). Skillnader i färgning intensitet kan tillskrivas använder antikroppar vid lite olika koncentrationer under färgning stegen. Figur 1 : Thymocyte lönsamhet efter behandling med hämmare. (A) experimentella disposition av de största stegen i analysen screening. Det finns tre föreslagna metoder för att stimulera och färgning av de tymocyter som används i aktiveringen analysen, nämligen (1) odling av tymocyter i standard 96 brunnar, följt av färgning med en konventionell centrifugering-baserade protokoll, (2) odling av tymocyter i standard 96 brunnar, följt av färgning med ett centrifugering-oberoende tvätt-protokoll, och (3) odling av tymocyter i små volymer plattor, följt av färgning i samma plattorna med hjälp av en centrifugering-oberoende tvätt protokoll. (B) Gating strategier som används i livskraft analyserna. Levande cellen grinden härrör från framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) tomter, som tidigare beskrivits17. Hämmare som ansågs vara alltför giftiga vid testade koncentrationen var föremål för ytterligare lönsamhet analyser vid 10-faldig lägre koncentrationer. Representativa hämmare-behandlade prover visas. Observera den gemensamma kontroll (DMSO-behandlade [DMSO]) som används för den 1 µM och 0.1 µM prover. (C) plattan layout av utspädda hämmare. En schematisk representation av pläterar av hämmare utspätt i DMSO till en koncentration av 500 x avsedda slutliga koncentration. Var representerar väl en unik hämmare; grå brunnarna är tomma. De koncentrationer som visas är den slutliga koncentrationen när de läggs till cellkulturer, nämligen 10 µM (Mörkröd), 1 µM (fuchsia) och 0,1 µM (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2 : Plattan layout thymocyte aktiveringen analysens. (Överst) Kolumn 1 och 12 är reserverade för kontroller, medan kolumnerna 2 till 11 är hämmare-behandlade prover (beige). Den negativa kontrollen (nonstimulated [NS]; grå) upptar brunnar A1 till D1, och den positiva kontrollen för celldöd (dexametasonbehandlade [DEX]; lila) upptar brunnar E1 H1. Kolumnerna 2 till 12 innehåller tymocyter stimuleras med anti-CD3/CD28 pärlor. Den positiva kontrollen för thymocyte aktivering (stimulerad prover [α-CD3/CD28]; grön) upptar brunnar A12 till D12, och fordonskontroll (stimulerad och DMSO-behandlade [α-CD3/CD28 + DMSO]; röd) upptar brunnar E12 till H12. (Botten) Flow flödescytometri tomter för aktiva kaspas-3 (ActCasp3), CD69, och TCRβ färgning av tymocyter gated inom stadsporten dubbel-positiv (DP). Representativa tomter av de olika kontrollerna visas. NS = nonstimulated; DEX = dexametasonbehandlade prover; Α-CD3/CD28 + DMSO = prover stimuleras med CD3/CD28-belagda pärlor och behandlade med DMSO; Α-CD3/CD28 = prover stimuleras med CD3/CD28-belagda pärlor. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3 : Screening av hämmare biblioteket på thymocyte aktiveringen. (A) summerade data aktiveringen analysens. Detta är resultatet av en representativ experiment visar normaliserade värden i celler med aktiverade kaspas-3 och CD69 uttryck för valda hämmare. Normalisering utfördes genom att jämföra andelen celler i aktiv-kaspas-3-positiva eller CD69-positiv gate till värdet i kontrollen DMSO-behandlade, som är satt att relativa värdet 0 i grafen. (B) valt FACS tomter. Flöde flödescytometri tomter hämmare som undertrycks både kaspas-3 aktivering och CD69 uppreglering (vänster överkant), undertryckta endast CD69 uppreglering (överst till höger), eller hade ingen effekt på kaspas-3 aktivering och CD69 uppreglering (nederst till vänster). Tomter av staurosporine-behandlade provet visas att illustrera effekterna av att använda en hämmare vid toxiska koncentrationer (nederst till höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4 : Jämförelse av de olika test protokoll. Flöde flödescytometri tomter för aktiva kaspas-3 (ActCasp3), CD69, och TCRβ färgning av DP tymocyter efter tre olika test protokoll. Fyra olika villkor är testade, nämligen den negativa kontrollen (nonstimulated [NS]), den positiva kontrollen för celldöd (dexametasonbehandlade [DEX]), fordonskontroll (stimulerad och DMSO-behandlade [α-CD3/CD28 + DMSO]), och en hämmare-behandlade prov (stimulerad och PIK-75-behandlade [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Konventionella = odling av tymocyter i standard 96 brunnar och färgning med en konventionell centrifugering-baserat protokoll; DA-tvätt = odling av tymocyter i standard 96 brunnar och färgning med hjälp av ett laminärt flöde tvätt protokoll; DA-kultur = odling av tymocyter i små volymer plattor och färgning i samma tallrikar med ett laminärt flöde tvätt protokoll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den screening strategi som föreslås här bedömer småmolekylär hämmare förmåga att undertrycka apoptotiska effekterna i tymocyter efter stimulering, förutom mer konventionella markörer av T-cells aktivering-CD69 uppreglering och TCR nedreglering . Ytterligare markörer kan också ingå att möjliggöra analys av olika thymocyte grupper³². En intressant aspekt av den aktuella analysen ligger i det faktum att hämmare som hindrar TCR signalering också skulle dämpa induktion av apoptos, ytterligare belysa skillnaden av TCR-oberoende effekter av hämmare kan ha på inducera celldöd. Dessutom tillåter en flow-flödescytometri-baserad analys användning av flera utläsningar som distinkta aktiveringen markörer, som kunde rapportera effekterna av hämmare om separata individuella grenar av TCR signalering. I det fallet presenteras här fanns hämmare som visade en differential inhibition av kaspas-3 aktivering och CD69 uppreglering. Eftersom vissa föreningar kan påverka städning funktioner såsom proteinsyntes eller vesikulär människohandel, är det inte förvånande att iaktta effekterna på uppreglering av de novo syntetiseras markörer (t.ex. CD69) men inte på posttranslationell ändringar (t.ex. proteolytisk aktivering av kaspas-3).

Som analysen presenteras här åtgärder apoptos som en avläsning, är det absolut nödvändigt att de latenta toxiska effekterna av de-hämmare inte skymmer resultaten. Till exempel i skärmen, vi inte späd staurosporine bortom 1 nM, trots att det fortfarande är giftigt för cellerna vid den koncentrationen. De representativa resultat är ense med staurosporine att vara en promiskuös Kinas-hämmare och inducerare av apoptos³³. Utan en tillräcklig utspädning av de föreningar som testade till giftfritt koncentrationer, är det möjligt att bortse från potentiella hits.

Screening strategin beskrivs här skulle vara svårt att tillämpa på människor till följd av komplikationer i samband med att få tillräckligt antal tymocyter för high-throughput screening. Det är dock möjligt att få mänskliga bräss prover från pediatric cardiac biopsier³⁴^,³⁵ eller från foster³⁶^,³⁷. Dock som TCR signalering vägar och den amino syra sekvenser av signalering proteiner bevaras i stor utsträckning mellan möss och människor, thymocyte analysen ger en användbar preliminära screening strategi, och några resultat erhålls med denna analys som använder mus tymocyter kan, sedan verifieras i primära humana lymfocyter.

En begränsning av konventionella centrifugering-beroende protokollet avser utsikterna till cellförlust, som kan hänföras till den process som omfattar steg såsom cell permeabilisering och centrifugering utgångsämnet art. Varje centrifugering och resuspension steg oundvikligen resulterar i förlust av celler. Medan sådana förluster inte kan vara kritiska för studier med ett begränsat antal prover, kan det innebära problem när de tillämpas i högre genomströmning screening, i synnerhet som assay format fortskrider från 96 – till 384 – till 1536-väl. Ett sätt att kringgå detta problem är med hjälp av cell-permeable fluorescerande kaspas sensorer³⁸ som möjliggör upptäckt av kaspas aktivering samtidigt undvika komplikationerna av cell permeabilisering och flera tvättar⁵. Alternativt, anställa en centrifugering-oberoende metod för att tvätta cellerna med laminärt flöde är också möjlig för att minimera cellförlust. Med en automatiserad plate tvätt station i samband med en vägg mindre tallrik, tvättas cellerna av laminärt flöde utan användning av en centrifug. Exponentiell utspädning av reagenser tillåter för en grundlig och effektiv sköljning av celler i mindre än 3 min, vilket representerar en motsvarande utspädning till två rundor av centrifugal tvätt. Utan yttre påfrestningar på grund av centrifugering, cellerna är mer livskraftig och cell förluster minimeras.

Vi undersöker också möjligheten att använda automatiserade plattan tvätt station efter odling av tymocyter i 96 brunnar U-botten pläterar och, även, odling av celler direkt i vägg-mindre plattor kompatibel med automatiserade plattan tvätt station. Odling av celler i väggen-mindre tallrikar aktiverat eliminering av alla centrifugering steg och minimerat cellförlust genom att eliminera behovet av en prov överföring över plattorna. Generellt är de tre olika protokoll är jämförbara i både stimulering effektivitet och färgning. Den automatisera tvätt stationen ger fördelen med automation, hastighet och effektivitet, vilket gör det lättare för högre genomströmning analys. Dessutom med ökad automatisering, tvätt stegen kan utföras snabbare, och det finns en större konsekvens mellan experiment eller praktiker. Tvätt stationen har dock vissa nackdelar: stora mängder tvätt buffertar krävs för bricka priming (150 mL per buffert förändring, varav 50 mL används för tvätt); extra omsorg behövs vid hantering av plattan att undvika eventuella korskontamination mellan brunnarna på grund av begränsad uppdelning mellan brunnarna av små volymer plattan; kvarvarande buffert av 25 µL i brunnarna efter tvätt nödvändiggör användning av reagenser beredd vid en högre än 1 x koncentration. För att lösa frågorna om residualvolym och begränsad volymkapacitet av plattan, kan ett tillbehör till expandera inkubation volymen från 70 µL till 150 µL läggas, att underlätta antagandet av konventionella protokoll. Medan automatiserad plattan hanteringssystem finns för närvarande, har de en betydande footprint jämfört med laminär Tvättsystemet, som är en liten enhet av ~ 1 kubikfot (~0.028 m³). Integrationen av centrifugering i automatiserade plattan hanteringssystem är dessutom utmanande, begränsa deras användning i cell tvätt. För närvarande finns det inga andra centrifug-oberoende cell tvätt instrument tillgängliga, såvitt vi vet.

Den screening strategi som presenteras här är kunna identifiera små molekyler och deras påstådda mål kinaser, som påverkar TCR signalering och T-cells aktivering. Biblioteket som används här omfattar främst småmolekylär hämmare av kinaser och kunde generera ett antal potentiellt intressanta träffar. Protokollet kan även appliceras lätt hämmare bibliotek av andra enzym klasser eller andra typer av små molekyler samt till bibliotek av andra föreningar (t.ex., olika makromolekyler). Protokollet kan också användas till skärmen andra celltyper, som perifera T-lymfocyter eller förevigade celler, inklusive de uttrycker transgena TCRs eller transporterar reporter system. Att identifiera och karaktärisera nya mediatorer av T-cell signalering kan förbättra vår kunskap om signalvägen och också stöd i utvecklingen av riktad terapi i immuna sjukdomar¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶. i alla, denna studie lägger till utbudet av tillgängliga alternativ för detektion av mediatorer av T-cell signalering via high-throughput screening analyser.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av bidrag från Singapore hälsoministeriets nationella medicinska forskningsrådet, NMRC CBRG15may017 och den Singapore ministeriet för utbildning, 2014-T2-1-136 (till N.R.J.G.).

Materials

RPMI	HyClone	SH30027FS
FBS	HyClone	SH3007103
L-Glutamine	HyClone	SH3003401
Sodium pyruvate	HyClone	SH3023901
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
b-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	516732
10X PBS	Vivantis	PB0344 – 1L
Kinase Screening Library (96-Well)	Cayman Chemical	10505	Exact contents of the library may vary
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902
anti-CD3/CD28 beads	Thermo Fisher Scientific	11452D
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit	BD Pharmingen	550480	Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody
DA-Cell Washer	CURIOX	HT1000
96-well DA-Cell Plate	CURIOX	96-DC-CL-05
Antibodies
CD3e	BioLegend	100236
TCRb	BD Biosciences	553174
CD4	BD Biosciences	740007
CD8	BD Biosciences	563786
CD69	eBioscience	25-0699-42
Inhibitors
TG003	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PKC 412	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Doramapimod	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Paclitaxel	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Erlotinib	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Necrostatin-5	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
NVP-BEZ235	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Phthalazinone pyrazole	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-879	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
1-NA-PP1	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Torin 1	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide II	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
BIBF 1120	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SMI-4a	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10657	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AS-703026	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Chelerythrine chloride	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Tunicamycin	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
GSK 1059615	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Ruxolitinib	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Necrostatin-1	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SB 505124	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
INK128	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Canertinib (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SB 431542	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PD 173074	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Valproic Acid (sodium salt)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PD 0325901	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SB 203580	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
VX-702	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Emodin	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CHIR99021	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
BIO	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Imatinib (mesylate)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Sunitinib Malate	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Gefitinib	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PP2	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
3-Methyladenine	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide I	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide IV	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide V	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
NSC 663284	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
D 4476	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
NU 7026	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
H-9 (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Indirubin-3'-monoxime	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
KN-62	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
KN-93	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CGP 57380	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Iso-Olomoucine	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
(S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide VIII (acetate)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
ST638	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SU 6656	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
LY364947	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SB 203580 (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10621	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
YM-201636	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
ZM 447439	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AS-041164	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
NVP-AEW541 (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PP242	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
ABT-869	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10622	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
17β-hydroxy Wortmannin	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10626	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SU 6668	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10572	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
N,N-Dimethylsphingosine	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
LY294002	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
U-0126	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Staurosporine	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
KN-92 (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AS-605240 (potassium salt)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
O-1918	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Y-27632 (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Leelamine	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PD 98059	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PD 169316	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
TGX-221	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
(S)-H-1152 (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AS-605240	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
D-erythro-Sphingosine C-18	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
OSU03012	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
JNJ-10198409	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Leelamine (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Arachidonic Acid Leelamide	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Lauric Acid Leelamide	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AS-252424	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10505	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PI-103	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PIK-75 (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Sphingosine Kinase Inhibitor 2	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Piceatannol	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SC-1	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
(R)-Roscovitine	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
BAY-43-9006	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10561	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AS-604850	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PI3-Kinase α Inhibitor 2	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
ML-9	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Triciribine	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Erbstatin Analog	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Kenpaullone	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Olomoucine	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-494	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-825	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-1478	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SB 216763	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SB 415286	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-17	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
H-8 (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
LFM-A13	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SC-514	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Apigenin	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-18	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10554	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
DRB	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
RG-13022	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
RG-14620	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-490	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-82	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-99	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-213	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-183	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Lavendustin C	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
ZM 336372	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
5-Iodotubercidin	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SB 202190	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10571	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Nilotinib	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
SP 600125	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
L-threo-Sphingosine C-18	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
H-89	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
HA-1077 (hydrochloride)	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-370	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Wortmannin	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
AG-1296	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
KT 5823	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Janex 1	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10574	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10575	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10576	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
NH125	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
TWS119	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
NSC 210902	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10577	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CAY10578	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
PD 184161	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
CCT018159	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library
Myricetin	Cayman Chemical	–	From the Kinase Screening Library

Referencias

Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. . Novel compounds. , (2003).
Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries. J. Vis. Exp. (143), e58946, doi:10.3791/58946 (2019).

Identifiering av mediatorer av T-cells Receptor signalering via Screening av kemiska hämmare bibliotek

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Divulgaciones

Acknowledgements

Materials

Referencias

Tags

Play Video

Citar este artículo

View Video

Identifiering av mediatorer av T-cells Receptor signalering via Screening av kemiska hämmare bibliotek

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Divulgaciones

Acknowledgements

Materials

Referencias

Tags

Play Video

Citar este artículo

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below