В Vitro анализов для оценки миграции, вторжения и распространения увековечен человека первого триместра трофобласта клеточных линий
Summary
Здесь мы представляем весьма доступный протокол для оценки клеточного движения в клетках человека трофобласта, используя три в пробирке анализов: скретч assay, transwell вторжения пробирного и распространения assay клетки.
Abstract
Движение клеток является критическое свойство трофобласты во время развития плаценты и ранней беременности. Беременности расстройств, таких как ограничение преэклампсии и внутриутробного роста, которые связаны с неадекватной трофобласта вторжения материнской сосудистую свидетельствует значение надлежащего трофобласта миграции и вторжения. К сожалению, наше понимание механизмов по которой плацента развивается от миграции трофобласты ограничен. В пробирке анализ миграции клеток через скретч assay является полезным инструментом в выявлении факторов, которые регулируют трофобласта мигрирующих потенциала. Однако этот assay только не определяет клеточные изменения, которые могут привести к миграции измененных клеток. Этот протокол описывает три различных в пробирке анализов, которые используются коллективно оценить движение клеток трофобласта: скретч assay, пробирного вторжения и распространения assay. Протоколы, описанные здесь, также могут быть изменены для использования в других клеточных линий для количественного определения клеточного движения в ответ на раздражители. Эти методы позволяют следователям для выявления отдельных факторов, которые способствуют движению клеток и обеспечить тщательное изучение возможных механизмов, лежащих в основе явного изменения в ячейке миграции.
Introduction
Плацентарный развития представляет собой решающий шаг в создании беременности, влияющие на здоровье матери и плода. Однако механистический основы, в которой происходит этот процесс полностью не поняты. Клетки миграция является важным биологическим процессом, который способствует создание и функции через плаценту во время беременности. После имплантации бластоцисты трофоэктодерму дифференцирует ворсинчатых трофобласты, которые покрывают поверхность хорионического ворсинки и участвуют в газ и обмен питательных веществ, и extravillous трофобласты (EVTs), которые мигрируют из от Вилли и вторгнуться материнской decidua и сосудистую1. Миграция EVTs имеет важное значение для реконструкции материнской спиральных артерий и создания uteroplacental циркуляции для поддержки роста плода2. Неадекватные трофобласта вторжения во время беременности приводит к плацентарных аномалии развития и может способствовать осложнений беременности, таких как преэклампсия, гестационного гипертензии, ограничение внутриутробного роста и преждевременных родов3, 4. Таким образом понимание факторов, которые влияют на трофобласта моторики имеет важное значение для определения путей, необходимых для нормального плацентации.
Трофобласта миграции контролируется сложной сети сигнальных молекул, включая факторы роста, цитокины, гормоны и ангиогенных факторов5. Из-за ограничений исследования плаценты в естественных условиях в пробирке анализов используя увековечен человека трофобласта клеток линии имели решающее значение для выявления факторов, способствующих подвижности трофобласта. Царапин и вторжения анализы широко использовались для количественной оценки роли отдельных молекул на трофобласта клеток миграции6,,78. Однако хотя и является полезным в тандеме, чтобы исследовать, как изменения в миграции может быть вызвано изменениями в ячейке инвазивность, эти два анализов не учитывают дополнительные механизмы, которые могут способствовать изменены показатели миграции клеток. Например сокращение скорости пролиферации клеток может привести к меньшее количество ячеек для миграции.
Здесь мы описываем количественные методы в пробирке для оценки миграции трофобласта, используя нуля, пролиферация клеток и клеток вторжения анализов. В скретч assay создан единый рану в монослое клеток, и миграции клеток, чтобы заполнить разрыв измеряется автоматизированных, покадровой изображений размер раны и плотность клеток в рану. Распространения assay клетки основывается на расчете соотношение клеток в каждый момент времени по сравнению с известным начальное количество клеток. В assay вторжения клетки клетки посеян на вершине камеру Вставка культуры внеклеточная матрица покрытием клеток (например, Transwell), и подсчитывается количество ячеек, которые вторгаются через внеклеточного матрикса в ответ на химио приманки.
Царапинам assay — простой и эффективный инструмент, который может использоваться для определения различных условий окружающей среды влияют на миграцию клеток. Распространение и вторжения анализов впоследствии может использоваться для определения вклада инвазивность общего изменения в ячейке миграции и пролиферации клеток. В совокупности эти анализы обеспечивают надежные измерения биологических процессов, которые могут способствовать подвижности клеток. Две линии клеток трофобласта увековечен первого триместра были использованы в описанных анализов, Swan.71 (Sw.71) и HTR-8/SVneo9,10. Однако эти анализы также могут быть оптимизированы для использования в других типах клеток для выявления ключевых модуляторы миграции клеток и вторжения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта процедура основывается на использовании миграции и вторжения анализов включить скорость пролиферации клеток как потенциальный вклад измеренных различия в движение клеток трофобласта. Вместе, эти в пробирке тестов используются простые и эффективные методы, которые могут использ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-р Хиль Mor за предоставление Sw.71 клеток. Это исследование было поддержано Маккерн Альберт ученый награда с.в.
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
Referencias
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
