JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

Uzun ömürlü plazma hücreleri insan Normal bellek B hücrelerine vitro farklılaştırma modelinde

Published: January 20, 2019
doi:
10.3791/58929
, , , ,
1IGH, CNRS,Univ Montpellier, 2Laboratory for Monitoring Innovative Therapies, Department of Biological Hematology,CHU Montpellier, 3UFR de Médecine,Univ Montpellier

Summary

Çok adımlı kültür sistemleri kullanarak, biz in vitro bir B hücre plazma hücre farklılaşması modeli için rapor.

Abstract

Plazma hücreleri (adet) antikorlar büyük miktarda salgılar ve aktive edilmiş B hücrelerinden geliştirmek. PC’ler kemik iliği veya mukoza bulunan nadir hücrelerdir ve humoral bağışıklık sağlamak. Düşük frekans ve konumu nedeniyle, PC’ler çalışmanın zor olduğunu insan. Biz PC için bir B rapor tüp bebek farklılaşma modeli içinde vivo meydana gelen sıralı hücre farklılaşması çoğaltmak izin sitokinler ve harekete geçirmek molekülleri seçili kombinasyonları kullanarak. Tüp bebek bu modelde, B hücreleri (MBCs) öncesi plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs) erken adet ayırt bellek ve son olarak, uzun ömürlü içine PC’ler, sağlıklı bireyler. kendi muadilleri için bir fenotip ile kapatın Ayrıca bir açık erişim Biyoinformatik GEP verilerin PC farklılaşma ile ilgili en önemli bilgiler analiz araçları inşa. Bu kaynakların insan B PC farklılaşma ve çalışmada çalışma için kullanılabilir, biz epigenetik faktörler gen ifade düzenlemesi sırasında PC farklılaşma için insan B araştırdık.

Introduction

Plazma hücreleri (adet) B hücrelerine farklılaşma humoral bağışıklık için zorunludur ve şirket ana bilgisayar enfeksiyonları1karşı korumak. B PC farklılaşma için transkripsiyon kapasite ve metabolizma antikor salgılanması için karşılamak için önemli değişiklikler ile ilişkilidir. B PC farklılaşma için kontrol transkripsiyon faktörleri kapsamlı bir şekilde inceledik ve B ve PC özel transkripsiyon dahil olmak üzere ortaya özel ağlar faktörler (TFs)2. B hücreleri, PAX5, BCL6 ve BACH2 TFs B hücre kimliği2,3koruyucularıyız. IRF4, BLIMP1 ve XBP1 PC TF kodlama PRDM1 indüksiyon B hücresi genleri söndürmek ve bir eşgüdümlü antikor salgılayan hücre transkripsiyon programı3,4,5teşvik. Koordine bu transkripsiyon değişiklikleri IG genlerin transkripsiyon aktivasyonu ile birlikte salgılanan formun immünglobulin ağır zincir2,3, membran-ilişkili form bir geçiş ile ilişkili 4. PC farklılaşma B’ye indüksiyon genlerin endoplazmik retikulum içinde yer ile bağlantılı ve Golgi aygıtı sentezi accomodating tarafından PC içinde önemli bir rol oynamak için bilinen gelişeceğini protein yanıt (UPR) harekete geçirmek ile eşlik eden işlevleri immünoglobulinler6,7salgılanan. TF XBP1 bu hücresel adaptasyon8,9,10‘ önemli bir rol oynar.

B hücreleri ve PC’ler humoral bağışıklık anahtar oyuncu var. Biyolojik anlama denetleyen üretim ve normal plazma hücrelerinin yaşaması gereken verimli immün yanıt-e doğru sağlamak ve otoimmünite veya bağışıklık yetersizliği önlemek için tedavi edici müdahalelere kritik işler. PC tam biyolojik karakterizasyonu, özellikle de insan engel anatomik konumlarda yer alan erken farklılaşma aşamaları ile nadir hücreler. Çok adımlı kültür sistemleri kullanarak, PC farklılaşma modeli için bir tüp bebek B bildirdin. Bu model sıralı hücre farklılaşma ve olgunlaşma vivo11,12,13. farklı organlarda meydana gelen üretir İlk adım, bellek B hücreleri dört gün boyunca CD40 ligand, oligodeoxynucleotides ve sitokin kombinasyonuna göre ilk aktif hale gelir ve preplasmablasts (PrePBs) ayırt etmek. İkinci adımda, preplasmablasts plasmablasts (PBs) ayırt etmek için CD40L ve oligodeoxynucleotides dürtme kaldırma ve sitokin kombinasyon değişen indüklenir. Üçüncü adımda, plasmablasts erken adet sitokin birlikte11,12değiştirerek ayırt etmek için indüklenir. Dördüncü adım tam olgun PC’ler bu erken adet kemik iliği stromal hücreler şartına orta ile kültür tarafından almak için kullanılmaya başlanan veya büyüme faktörleri13seçili. Bu olgun PC’ler birkaç ay Tüp Bebek hayatta kalmak ve immünglobulin (Şekil 1) yüksek miktarda salgılar. İlginçtir, tüp bebek modelimiz koordine transkripsiyon değişiklikler ve algılanan içinde vivo11,12,13,14-ebilmek var olmak PC aşamaları için farklı B fenotip tablodur ,15. Adet nadir hücrelerdir ve tüp bebek farklılaşma modelimiz insan B PC farklılaşma için çalışmaya izin verir.

Protocol

Protokol kuralları Helsinki Bildirgesi ve Montpellier Üniversitesi hastane merkezi Sözleşmesi Biyolojik kaynakların doğrultusunda izler. 1 vitro Normal plazma hücre farklılaşması modeli. Not: PC’ler bir dört adımlı kültür11,12,13-oluşturulur. B hücre amplifikasyon ve farklılaşma Periferik kan hücrele…

Representative Results

Tüp Bebek normal PC farklılaşma genel yordamı Şekil 1′ de temsil edilir. Burada sunulan iletişim kuralını kullanarak, yeterli miktar ile ex vivo insan örnekleri elde edilemedi hücre oluşturabilir. Transkripsiyon faktörleri PC farklılaşma ilgili karmaşık ağın rolünü araştırıldı rağmen anahtar PC farklılaşma transkripsiyon ağlar düzenleyen mekanizmalar kötü bilinen kalır. Hücresel başkalaşım çoğunlukla epigenetik ve transkr…

Discussion

İnsanda, PC hücreler nadir farklılaşma kademeli tam biyolojik karakterizasyonu engel anatomik yerlerde yer alıyor. Bir tüp bebek B nerede harekete geçirmek molekülleri ve sitokinler çeşitli birleşimleri ardından gerçekleşen sıralı hücre farklılaşması çoğaltmak için uygulanan multi-step kültür sistemleri kullanarak PC farklılaşma modeli için geliştirdiğimiz farklı organlar/dokularda vivo11,12,13.</p…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Fransız Inca (Institut National du kanser) gelen hibe tarafından desteklenmiştir Enstitüsü (PLBIO15-256), ANR (Tie-atla) ve ITMO kanser (MM ve TT).

Materials

anti-CD2 magnetic beads Invitrogen 11159D
Anti-CD138-APC Beckman-Coulter  B49219
Anti-CD19-APC BD 555415
Anti-CD20-PB Beckman-Coulter  B49208
Anti-CD27-PE BD 555441
Anti-CD38-PE Beckman-Coulter  A07779
Anti-histidine R&D Systems MAB050
CpG ODN(PT) Sigma T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human Transferin Sigma-Aldrich T3309
IFN-α Merck Intron A
IMDM Gibco 31980-022
Recombinan Human CD40L-hi R&D Systems 2706-CL
Recombinant Human APRIL R&D Systems 5860-AP-010
Recombinant Human IL-10 R&D Systems 217-IL-
Recombinant Human IL-15 Peprotech 200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
  3. Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
  4. Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
  5. Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
  6. Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
  7. Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
  8. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  9. Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
  10. Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
  11. Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
  12. Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
  13. Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
  14. Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
  15. Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
  16. Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, 28-49 (2007).
  17. Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
  18. Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
  19. Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
  20. Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
  21. Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
  22. Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
  23. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
  24. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
  25. Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
  26. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
  27. Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
  28. Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
  29. Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
  30. Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
  31. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
  32. Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
  33. McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
  34. Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
  35. Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
  36. Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
  37. Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
  38. Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
  39. Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
  40. Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
  41. Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
  42. Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
  43. Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
  44. Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).

Tags

In Vitro DifferentiationHuman Normal Memory B CellsLong-lived Plasma CellsPlasma Cell DifferentiationB2 Plasma Cell DifferentiationTranscriptional ChangesPhenotypeBioinformatic ToolsMemory B Cell PurificationCD40 LigandAnti-polyhistidine Monoclonal Antibody

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Jourdan, M., de Boussac, H., Viziteu, E., Kassambara, A., Moreaux, J. In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells. J. Vis. Exp. (143), e58929, doi:10.3791/58929 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image