Спонтанного формирования и перегруппировки искусственных липидов нанотрубок сетей как модель снизу вверх для эндоплазматического ретикулума
Summary
Твердое поддерживается, белка бесплатно, фосфолипидный бислоя мембраны (DLBM) могут быть преобразованы в сложные и динамичные липидов нанотрубок сетей и может служить 2D модели снизу вверх эндоплазматического ретикулума.
Abstract
Мы представляем удобный способ сформировать модель структурного органеллы снизу вверх для эндоплазменный ретикулум (ER). Модель состоит из весьма плотной липидный нанотрубок, которые, с точки зрения морфологии и динамика, напоминающие ER. Сети являются производными от фосфолипидов двойной бислоя мембраны патчи, придерживаясь прозрачной Al2O3 субстрата. Адгезия при посредничестве Ca2 + в буфере окружающего. Последующего истощения Ca2 + с помощью BAPTA/ЭДТА приводит Ретракция мембраны, что приводит к спонтанной липидов нанотрубок формирование сети. Этот метод только состоит из фосфолипидов и microfabricated поверхностей для простого формирования модели ER и не требует добавления белков или химической энергии (например, GTP или АТФ). В отличие от 3D морфология сотовой эндоплазматического ретикулума модель двумерной (хотя и поддерживаются размеры нанотрубок, геометрии, структура и динамика). Эта модель уникальной в vitro ER состоит только из нескольких компонентов, легко построить и можно наблюдать под микроскопом света. Результирующая структура может быть далее украшен для дополнительной функциональности, например добавления ER-связанных белков или частиц для изучения явления переноса среди трубы. Искусственные сети, описанные здесь являются подходящей структурных моделей для сотовых, ER, чьи уникальные характерные морфология было показано, быть связаны с его биологической функции, тогда как подробности относительно формирования трубчатых домена и перестановки в пределах понимаются все еще не полностью. Мы отмечаем, что этот метод использует Al2O3 микроскопия тонких пленочным покрытием coverslips, которые являются коммерчески доступных, но требуют специальных заказов. Таким образом желательно, иметь доступ к микротехнологий фонда для подготовки.
Introduction
ER осуществляет важнейшие задачи в биологических клеток, включая сворачивание белков, синтез липидов и кальция регулирование1,2. Морфология ER встроенных функций, которые она выполняет. Он сочетает в себе Вселенский стеки и плотной динамические трубчатых доменов, которые постоянно взаимодействуют с цитоскелета и проходят постоянное движение и перегруппировки. Некоторые ремоделирования, что ER структуры претерпевают включают в себя непрерывное преобразование между плоских листов и труб, образование пузырьков от или фьюжн ER люмен, удлинение существующие трубы, трубки стягивания, фьюжн и поломки3. Своеобразная структура трубчатых сетей напористо неблагоприятно. Путей и механизмов, в которых ER формирует и утверждает, что эта организация также, как это относится к своей функции не полностью осознана4,5.
Известно, что ER неисправности когда он теряет свое состояние гомеостаза, что приводит к ER стресс, состояния, вызванные увеличение синтеза белка, накопление смятых протеинов, или изменения в Ca2 + и окислительного баланс. ER стресс в свою очередь вызывает деформации естественных морфологии органеллы, специально, тревожным сетевые организации6,7. Как ответ ячейка активирует механизм ремонта вернуться в состоянии гомеостаза. Неудача в ремонт может привести к апоптозу ER-индуцированной клеток, что способствует несколько метаболических и дегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, диабет 2 типа, болезни Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и несколько других7, 8. Текущие исследования цели Организации трубчатых ER сетей, и несколько исследований сосредоточены на восстановлении ER в пробирке2. Несколько существующих моделей2,9,10 требуют белки инициировать и поддерживать мембраны кривизны3,11 и помочь достичь свою форму органеллы. Очевидно модель системы, которые отражают некоторые из ключевых структурных и организационных особенностей ER и обеспечивают доступ к расширенные экспериментальных исследований пользуются большим спросом.
Мы представляем здесь процедур для подготовки снисходительный, белка/химической энергии свободной, динамичной в vitro модели ER, обеспечивая базовую платформу для изучения морфологии ER и связанных с ними функций4. В этом методе модель ER изготовлен с подхода снизу вверх, используя только несколько элементов, в которых молекулы интерес может быть интегрирована добавить сложности. Сеть представляет собой ER структуры и динамики. Кроме того обратимые преобразования между плоской мембраны и трубы, образование везикул от трубы, трубки фьюжн, раздвижные и втягивание все наблюдается. Помимо выступающей как модель снизу вверх для неполно понимается сотовой ER, липидов маршрут к сети нанотрубок, указанных в настоящем Протоколе может применяться для исследователей, изучая самостоятельной сборки, Нанофлюидика, сингл молекулы и коллоидной явления переноса, Marangoni потока и других связанных с этим областей. Только молекулярный строительных блоков, используемых в нашем методе являются фосфолипидов. Протокол требует мало лабораторных работ и основного оборудования и доступен для включения дополнительных элементов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В ходе последовавшего обсуждения описаны важные шаги, возможные изменения и ограничения протокола. Первым важным шагом является надлежащее Ассамблея камеры наблюдения, учитывая, что адгезии PDMS кадра на Al2O3 поверхность неразрывно слаба. В случае, где кадра не прилегали к подложке содержание будет вытекать из камеры для наблюдения и эксперимента будет прийти к остановке. Основные факторы, которые препятствуют надлежащей герметизация поверхности и рамка 1) является отсутствие тщательной очистки (повторно используется) PDMS кадра и 2) воздушные пузыри, которые иногда получить в ловушке между рамой и субстрата. Следует использовать рамку PDMS недавно подготовленных или тщательно очищены. Рамы следует промыть до и после каждого использования изопропанолом, следуют промывка водой ди и сушка феном с азотом. Al2O3 поверхности не требуют предварительной очистки, так как они изготавливаются в среде чистых и хранится в герметичных контейнерах до использования. Благодаря Амфотерные характер Al2O3оно не должно подвергаться настоятельно кислой или основные решения. Другие проекты для камеры наблюдения могут использоваться, в зависимости от доступности отдельных установки. Важные особенности этой палаты являются свободный доступ к жидкого образца с открытым верхом и инертность материала рамы в отношении используемых решений и образцы. Размеры камеры также являются важным фактором, поскольку они должны учитывать объёмом от 0,5 до 1 мл. Поскольку используемые поверхности обычно стандартного размера coverslips (24 x 60 мм), объем камеры главным образом определяется толщина рамы. К нашему знанию прокладки с учетом размера и глубины, которая может вместить образец томов, обычно обрабатываются в настоящем Протоколе не коммерчески доступных. Мы поэтому посвятил раздел в протоколе детали изготовления и сборки камеры выборки.
Другим важным шагом в этом протоколе является буфером обмена. На этом шаге проблема сроков, необходимых для выполнения этого обмена. Распространение MLV при контакте с Al2O3 субстрат мгновенного, и постоянное расширение DLBM приводит к его сверлении, Завершение эксперимента (рис. 2A, B). Таким образом следует постоянно контролировать распространение, и буфера обмена должны выполняться своевременно. Обмен не должно выполняться слишком быстро после инициализации распространения, с тем чтобы позволить мембраны патчи для достижения оптимального размера (100-200 мкм в диаметре). С другой стороны непрерывное прилипания на поверхности приводит к высокой мембраны напряженности, которая ведет к сверлении. Таким образом все мембраны патчей в конечном итоге разрыв, если распространение не прерывается. Сроки сверлении отличается для каждого патч, так как это зависит от размера и внутренняя структура MLV и доступности липиды нем. Следовательно на момент обмена следует организовать до timepoint, на которой ООН разрыв патчи с оптимальных размеров представляют большинство всего населения. Еще одна проблема в буфер обмена шаг является скорость удаления и добавления буферов. Выполнения этой подстановки слишком быстро имеет пагубное влияние на окончательный мембранных структур (рис. 2C-E). Чрезмерная добыча Ca2 +– HEPES буфера, не оставляя тонкую пленку жидкости на подложке, приводит к сушеные и необратимо испорченный мембраны патчи (рис. 2C). Даже если надлежащее количество жидкости поддерживается на поверхности, резкое добавление буфера хелатором-HEPES также вызывает возмущений мембранных структур. Рисунок 2 D,E показывает типичный вид эжекции нарушается мембраны патчей. Общие морфологические нарушения не обязательно влияют динамические свойства окончательные структуры (т.е., трубчатые перестановки в оставшихся районах по-прежнему будет происходить). Однако он станет трудно наблюдать за материальное преобразование на деформированной структуры. Например Рисунок 2D, было бы сложно определить направление, к которому убирается MLV DLBM.
Один из возможных изменений протокола является состав липидов используется. Основное внимание уделялось фосфолипидов, которые доминируют состав ER в млекопитающих и дрожжей16 (е. g., фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламина (PE) и фосфатидилинозитол (PI). Оригинальные эксперименты были проведены с использованием ПК и PI смеси4. В представленные результаты была использована смесь PC и ДОПИНГ и производная PE. Однако не все произвольные липидной композиции были найдены для создания трубчатых структур, полученные через этот протокол. Несколько других смесей экспериментально исследованы липидов включают всего сердца экстракт, экстракт фасоли сои Полярный, E. coli экстракт полярных, смеси ПК с stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) в различных соотношениях и смеси из Серина (PS) PC-PE-Пи-Posphatidyl в различных соотношениях. Поскольку структуры трубчатые мембраны обладают высокой кривизны и требуют специальных расположение молекул отдельных липидов, ожидается, что наблюдаемое явление является липидного состава конкретных.
Еще одно изменение, применяемые в настоящем Протоколе является метод для изготовления поверхности. Здесь МОП была использована для изготовления Al2O3 с покрытием coverslips. Это отличается от метода первоначально сообщалось осаждения, реактивного распыления4. Хотя это указывает, что метод альтернативного поверхности изготовление по-прежнему может привести к ER-как Штенгель, одно важное ограничение, как представляется, специфики поверхности материала. Режим распространения и прочность сцепления сильно зависит от свойств поверхности материала, которые влияют такие факторы, как электростатических взаимодействий, смачиваемость, гидрофобность и шероховатости поверхности. Al2O3 поверхности обеспечивают оптимальный адгезионная прочность, и липидной пленки можно оба придают достаточно сильно распространилась как двойной липидного бислоя мембраны и отсоединить формы трубчатых сетям после удаления ионов Ca2 + . Ранее мы тестировали же эксперимент с SiO2, в котором multilamellar везикулы распространения как двойной липидного бислоя мембраны, но не трубчатых сети формирование наблюдалось при добавлении хелаторов17. Только на Al2O3 наблюдаются де вложений и трубку или плазменного травления Аль18. Наши исследования показали, что параметр войска, ведущие к такое явление является Зета потенциал поверхностей, для которых Аль и Al2O3 были близко к нулю (mV) и SiO2 значительно отрицательным. Зета потенциал боросиликатное похож на SiO219; Таким образом адгезии липидной пленки на боросиликатное столь же сильным и необратимым. В самом деле multilamellar липидов водохранилище контакт с поверхностями боросиликатное обычно приводит к немедленному разрыва и формирования одного липидных бислоев20. Al2O3 поверхности требуется для этого протокола не легко или коммерчески доступных. Они могут однако, быть пользовательские приказал от производителей стекла и субстрат специальности. Доступ к чистой комнаты с оборудованием производства тонкопленочных настоятельно рекомендуется.
Другие существующие методы снизу вверх для изготовления трубчатых сети ER-как2,10 включать белки, а также ввода химической энергии (например., GTP и АТФ). Рапопорт и коллеги2 сообщили формирование ER-сетей на стекло coverslips в пробирке путем смешивания мембраны изгиб белков, присутствующих в ER, фосфолипидов и ГТФ. Работы по Bachand и др. 10 показано, как такие динамические трубчатых сети могут быть созданы с помощью молекулярных моторов и СПС как источника энергии. Этот протокол представил не требуют мембранных белков или гидролиза органических соединений для энергетики. Только основные компоненты являются твердый субстрат и фосфолипидов. Очистки и извлечения белков не требуются. Этот протокол обеспечивает, с точки зрения простоты составных молекул, самой простой модели ER.
С этой основной, на основе липидов ER модель создана здание вверх сложности путем добавления ER-связанный компонентов представляет интерес, так как он позволяет расследования отдельных воздействия на систему. Подобно к фактической ER сетей, трубы в модели являются динамическими. Спряжение для и миграции помечены мембранных белков, или флуоресцентные частицы во всей трубчатой сети, может дать информацию о направлении движения мембраны. Инкапсуляция и мониторинг флуоресцентный жидкости внутри DLBM и трубы во время преобразования и возможное сопоставление внутриканального контента транспорта может служить еще одним направлением. Наконец переход от 2D модели ER, в результате этого протокола к 3D гладкая модель ER может быть принят путем инкапсуляции сетей в архитектурах гидрогеля.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим профессора Aldo Jesorka из Чалмерский технологический университет в Швеции за его бесценную комментарии на рукопись. Эта работа стала возможной благодаря финансовой поддержке, полученной от Грант проекта научно-исследовательского совета Норвегии (Forskningsrådet) 274433, UiO: окружающей среды конвергенции наук о жизни, Шведский научно-исследовательский совет (Vetenskapsrådet) проект Грант 2015-04561, а также начальное финансирование центра молекулярной медицины Норвегии и факультет математики и естественных наук в Университете Осло.
Materials
| Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
| Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
| Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
| Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
| Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
| Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
| Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
| Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
| Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
| L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
| Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
| PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
| TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
| Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
| Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
| Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
| Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
| Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
| Pressure meter – Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
| HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
| HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
| Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
| Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
| Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
| Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
| 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
| Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
| Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
| Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
| Heating and drying oven – venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
| Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
| Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
| Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
| Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24×60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
| Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
| Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
| Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
| White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |
Referencias
- Chen, S., Novick, P., Ferro-Novick, S. ER structure and function. Current Opinion in Cell Biology. 25 (4), 428-433 (2013).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
- Pendin, D., McNew, J. A., Daga, A. Balancing ER dynamics: Shaping, bending, severing, and mending membranes. Current Opinion in Cell Biology. 23 (4), 435-442 (2011).
- Bilal, T., Gözen, I. Formation and dynamics of endoplasmic reticulum-like lipid nanotube networks. Biomaterials Science. 5 (7), 1256-1264 (2017).
- Shibata, Y., et al. Mechanisms determining the morphology of the peripheral ER. Cell. 143 (5), 774-788 (2010).
- Ozcan, L., Tabas, I. Role of endoplasmic reticulum stress in metabolic disease and other disorders. Annual Review of Medicine. 63, 317-328 (2012).
- Yamanaka, T., Nukina, N. ER dynamics and derangement in neurological diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
- Taalab, Y. M., et al. Mechanisms of disordered neurodegenerative function: Concepts and facts about the different roles of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK). Reviews in the Neurosciences. , (2018).
- Shemesh, T., et al. A model for the generation and interconversion of ER morphologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 5243-5251 (2014).
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Sackmann, E. Endoplasmatic reticulum shaping by generic mechanisms and protein-induced spontaneous curvature. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 153-160 (2014).
- Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6, 791 (2011).
- Hook, D. A., Olhausen, J. A., Krim, J., Dugger, M. T. Evaluation of Oxygen Plasma and UV Ozone Methods for Cleaning of Occluded Areas in MEMS Devices. Journal of Microelectromechanical Systems. 19 (6), 1292-1298 (2010).
- Gözen, I., et al. Fractal avalanche ruptures in biological membranes. Nature Materials. 9 (11), 908-912 (2010).
- Lobovkina, T., Dommersnes, P., Joanny, J. -. F., Hurtig, J., Orwar, O. Zipper Dynamics of Surfactant Nanotube Y Junctions. Phys Rev Lett. 97, (2006).
- van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (2), 112-124 (2008).
- Gözen, I., et al. Repair of large area pores in supported double bilayers. Soft Matter. 9 (10), 2787-2792 (2013).
- Gözen, I., et al. Thermal migration of molecular lipid films as a contactless fabrication strategy for lipid nanotube networks. Lab on a Chip. 13 (19), 3822-3826 (2013).
- Sides, P. J., Hoggard, J. D. Measurement of the Zeta Potential of Planar Solid Surfaces by Means of a Rotating Disk. Langmuir. 20 (26), 11493-11498 (2004).
- Nissen, J., Jacobs, K., Rädler, J. O. Interface Dynamics of Lipid Membrane Spreading on Solid Surfaces. Physical Review Letters. 86 (9), 1904-1907 (2001).
