電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

酵素機構と反応速度論については、測定値が統計平均を表す酵素分子の数百万人に何千人もの人口を持つアンサンブルまたはマクロ レベルで通常取得されます。それは、ただし、酵素など複雑な高分子の行動における不均一性を発揮、アンサンブルのレベルで観察される分子メカニズムが必ずしも当てはまらないすべての分子のために知られています。最後の二十年の¹中に新興の方法の様々 な個々 の分子スケールのような逸脱が広く単一酵素の研究によって確認されました。特に、個々 の酵素活動を蛍光検出は、酵素活動^2,3の不均一性を調査したり、いわゆるメモリー効果 (低の期間によって成功した高い酵素活性の期間を発見に使用されています活動と逆)^4,5。

多くの単一の酵素の研究は、酵素表面または空間的固定連続観測の視野で十分な長さのままに別の方法でに固定されている必要があります。酵素カプセル化リポソーム表面酵素または蛋白質蛋白質の相互作用の^6,7による悪影響を防止しながら酵素固定化を有効にするのに示されています。また、リポソームは、その天然の脂質二分子膜環境の^8,9,10で単一膜蛋白質を研究するユニークな可能性を提供しています。

膜タンパク質、トランスポーター、クラス蛋白質は脂質二重膜 (例えばリポソーム)^{11に再構成されたときにだけ勉強することができます動作、セル膜を渡る物質の方向転流を練習します。 12,13}。たとえば、プロトン透過経路、原核生物と真核生物の電子輸送鎖のいくつかの酵素によって展示は ATP 合成に使用されるプロトン動機力を作成することによって細胞呼吸において重要な役割を果たしています。この場合、多くの場合このプロセスの詳細なメカニズムは、とらえどころのないままがプロトン ポンプ機能は電子伝達と結合されます。

最近では、プロトン ポンプの大腸菌(シトクロムbo₃) ターミナル ユビキノール酸化酵素の単一の酵素の活性を研究する電気化学とカップル蛍光検出する可能性を示した¹⁴リポソームに再構成しました。これEからリポソームの内腔 pH 感応膜不浸透性蛍光色素のカプセル化によって達成されました。大腸菌極性脂質 (図 1 a)。タンパク質の量は、ほとんどリポソームは (ポアソン分布) によるとないまたは 1 つだけ溶解酵素の分子をも含んだに最適化されていました。シトクロムbo₃の 2 枚の基板は、ユビキノンをソリューションでリポソームと (アンビエント) 酸素を形成脂質ミックスに追加することによって提供されました。リポソームは半透明な超滑らかな金電極、6 mercaptohexanol の自己組織化膜で覆われているまばら吸着します。最後に、電極は簡単な分光電気化学セル (図 1 b) の下部にマウントされています。キノン プールの酸化還元状態の電気化学的制御により、柔軟にトリガーしたり、または pH 感受性色素によってプロトン透過の結果としてリポソームのルーメン内の pH の変化を監視するために使用中にいつでもでも酵素反応を停止する 1 つ、酵素。使用して 2 番目、脂質バインド蛍光染料、サイズおよび個々 のリポソームのボリュームの蛍光強度を決定することができます、このように酵素のプロトン ポンプ機能の定量化。この手法を使用すると、特にわかったシトクロムbo₃分子がプロトン動機力をすばやく消える自然リーク状態に入ることができます。この記事の目的は、詳細に単一リポソーム測定の手法を紹介します。