Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Informationen über Enzym Mechanismen und Kinetik ist in der Regel auf das Ensemble oder makroskopischen Ebene mit Enzym Bevölkerung in die Tausende bis Millionen von Molekülen, erhalten wo Messungen einen statistischen Durchschnitt darstellen. Es ist jedoch bekannt, dass komplexe Makromoleküle wie Enzyme Heterogenität in ihrem Verhalten zeigen können und molekulare Mechanismen beobachtet auf der Ensemble-Ebene nicht unbedingt für jedes Molekül gelten. Solche Abweichungen der einzelnen Molekül-Skala wurden weitgehend durch Studien der einzelnen Enzyme mit einer Vielzahl von Methoden, die in den letzten zwei Jahrzehnten¹bestätigt. Vor allem, wurde Fluoreszenz-Detektion von einzelnen Enzymaktivität zur Heterogenität der Enzyme Aktivität^2,3 zu untersuchen oder entdecken den sogenannten Memory-Effekt (Perioden der hohen Enzyme Tätigkeit ist es gelungen, durch Zeiten der niedrigen Aktivität und umgekehrt)^4,5.

Viele einzelne Enzymstudien erfordern, dass die Enzyme auf der Oberfläche oder räumlich feste auf andere Weise ausreichend lange in das Sichtfeld für kontinuierliche Beobachtung bleiben immobilisiert sind. Enzym-Kapselung in Liposomen nachweislich Enzym Immobilisierung und verhindern, dass mögliche negative Auswirkungen aufgrund der Oberfläche-Enzym oder Protein-Protein Interaktionen^6,7zu aktivieren. Darüber hinaus bieten die Liposomen eine einzigartige Möglichkeit einzelne Membranproteine in ihrer natürlichen Lipid Bilayer Umwelt^8,9,10zu studieren.

Eine Klasse von Membranproteinen, Transporter, übt eine direktionale Translokation von Stoffen über die Zellmembran, ein Verhalten, das nur untersucht werden kann, wenn Proteine in der Lipid Bilayer (z.B. Liposome)^{11wieder hergestellt werden, 12,13}. Zum Beispiel spielt Protonen-Translokation, ausgestellt durch mehrere Enzyme von prokaryotischen und eukaryotischen Elektronentransport Ketten, eine wichtige Rolle in der Zellatmung durch die Schaffung einer Proton-treibende Kraft für die ATP-Synthese verwendet. In diesem Fall ist das Proton Pumpen Aktivität an den Elektronentransfer gekoppelt, obwohl der genaue Mechanismus dieses Prozesses oft schwer fassbar bleibt.

Vor kurzem haben wir die Möglichkeit, paar Fluoreszenz-Detektion mit Elektrochemie, Proton, die Aktivität der einzelnen Enzyme von der Klemme Ubiquinol-Oxidase von Escherichia coli (Cytochrom Bo₃) Pumpen zu studieren die Liposomen¹⁴wieder hergestellt. Dies wurde erreicht durch Verkapselung von einer pH-Sensitive Membran undurchlässig Leuchtstofffärbung in das Lumen der Liposome aus E. vorbereitet coli polaren Lipide (Abbildung 1A). Die Protein-Menge wurde optimiert, so dass die meisten Liposomen entweder keinen oder nur einen rekonstituierte Enzym-Molekül (nach Poisson-Verteilung) enthalten. Die beiden Substrate von Cytochrom Bo₃ wurden zur Verfügung gestellt, indem Sie die Lipid-Mischung, die die Liposomen und (ambient) Sauerstoff in Lösung gebildet Ubiquinon hinzufügen. Die Liposomen sind dann dünn auf einer halbtransparenten ultrasanfte gold Elektrode, bedeckt mit einer selbst-zusammengebauten monomolekularen Film des 6-Mercaptohexanol adsorbiert. Zu guter Letzt wird die Elektrode an der Unterseite einer einfachen Spectroelectrochemical Zelle (Abbildung 1 b) montiert. Elektrochemische Quinone Pool Redox staatlicher Kontrolle erlaubt es flexibel auslösen oder die enzymatische Reaktion jederzeit zu stoppen, während der pH-Sensitive Farbstoff zur pH-Wert-Änderungen in das Lumen der Liposomen durch Protonen-Translokation durch Überwachung dient der Enzyme. Durch die Verwendung der Fluoreszenzintensität von einem zweiten und Lipid gebundener Fluoreszenzfarbstoff, die Größe und das Volumen der einzelnen Liposomen kann ermittelt werden und somit die Quantifizierung des Enzyms Proton Pumpen Aktivität. Mit dieser Technik fanden wir vor allem, dass Cytochrom Bo₃ Moleküle in der Lage sind, einen spontanen Leck Zustand zu schließen, die schnell verflüchtigt sich die Protonen treibende Kraft. Das Ziel dieses Artikels ist es, die Technik der einzelnen Liposomen Messungen im Detail vorstellen.