العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية
Summary
هنا، نحن نقدم تقنية microsurgical رواية لعزل الخلايا الجذعية العصبية من الماوس الجنين ه13 ganglionic نيافة.
Abstract
هي multipotent الخلايا الجذعية العصبية (الود) ويمكن أن تؤدي إلى ثلاثة أنواع الخلية الرئيسية للجهاز العصبي المركزي (CNS). الثقافة في المختبر ، والتوسع في الود توفير مصدر مناسب للخلايا لعلماء الأعصاب لدراسة وظيفة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية جنبا إلى جنب مع التفاعلات الخاصة بها. وهناك عدة تقنيات الإبلاغ عنها لعزل الخلايا الجذعية العصبية من أدمغة الثدييات الكبار أو الجنين. أثناء عملية ميكروسورجيكال لعزل الود من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي الأجنة، من المهم جداً للحد من الضرر لخلايا الدماغ للحصول على أعلى نسبة من الخلايا الجذعية حية وقابلة للتوسيع. تقنية ممكنة للحد من التوتر خلال عزل هذه الخلايا من المخ الجنين الماوس هو الحد وقت الجراحة. هنا، نحن إظهار تقنية المتقدمة لعزل السريع لهذه الخلايا من الماوس الجنين ه13 ganglionic نيافة. وتشمل الإجراءات الجراحية حصاد الأجنة الماوس13 ه من الرحم، وقطع fontanelle أمامي للجنين مع تلميح إبرة بنت، استخراج المخ من الجمجمة، ميكروديسيكشن الدماغ معزولة لحصاد نيافة جانجليونيك، تفكك الأنسجة المقطوع في المتوسط القومي للحصول على تعليق خلية مفردة، وأخيراً طلاء الخلايا في ثقافة تعليق لتوليد نيوروسفيريس.
Introduction
تتواجد الخلايا الجذعية العصبية (الود) في مناطق مختلفة من الدماغ الكبار والأجنة، ولديهم ميل لإنشاء أنواع مختلفة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية1. مناطق سوبفينتريكولار في المخ الثدييات الكبار2 ونيافة ganglionic في الدماغ الجنين بمجلس الأمن القومي المناطق الغنية3. في الدماغ، يسلم نيافة ganglionic معظم إينتيرنيورونس القشرية وخاصة جابايرجيك إينتيرنيورونس3. وهناك أيضا أساليب أقل الغازية لتوليد الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا) أو استخدام الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) التي تقلل من الطلب على الحيوانات. وعلى الرغم من حقيقة أن توليد الود من بتوليدا أو إيبسكس هو ممكن4،5، له بعض المزايا والعيوب مقارنة بعزل الخلايا الجذعية العصبية من الكبار أو الجنين الدماغ6،7، 8. البروتوكولات من أجل حفز التفريق بين بتوليدا وإيبسكس تجاه الخلايا العصبية تعمل دائماً الوقت والتكلفة المستهلكة ومعدل النجاح (70-80% نيستين الخلايا إيجابية)5 هو أقل مقارنة مع العزل مباشرة من الود من (الدماغ الحيواني أكثر من 99% نيستين الخلايا إيجابية)9. وعلاوة على ذلك، تفقد الخلايا الجذعية ميلها الاستقرار والتمايز الوراثي بعد عدة ممرات10،11. على الرغم من أن هناك تقارير أخرى جديدة حول التحويل المباشر للخلايا الجسدية في الود، هذه الخلايا هي المهندسة وراثيا ولا يمكن الوصول إليها بسهولة في كل مختبر12. ولذلك، لا يزال هناك طلب كبير لعزل الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الحيواني؛ فمن الممكن للحد من كمية الاستخدام الحيواني عن طريق تحسين التقنيات الجراحية. تقليل وقت الجراحية وتحسين التقنيات، فمن الممكن للحفاظ على الخلايا بعيداً عن الأضرار والحصول على أعلى معدل للود من كل الحيوانات.
نقدم لك هنا، أسلوب مبسط واستنساخه لعزل الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الجنين13 الماوس ه.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام مصدر مناسب للخلايا الجذعية العصبية مهم جداً لعلماء الأعصاب. يمكن حصاد الخلايا الجذعية العصبية من مناطق مختلفة في الدماغ الجنين وأنها يمكن أن تولد أنواع محددة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. هناك عدة طرق لتحريض تمايز الخلايا الجذعية العصبية حملها على توليد الخلايا الدبقية و?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المعهد Royan.
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
Referencias
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neurociencias. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
