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Investigación sobre el cáncer

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Published: January 29, 2019
doi:
10.3791/58841
, , ,
1Royal (Dick) School of Veterinary Studies and Roslin Institute,University of Edinburgh, 2MRC Centre for Reproductive Health,University of Edinburgh, 3Edinburgh Phenotypic Assay Centre,University of Edinburgh, 4Cancer Research UK Edinburgh Centre, MRC Institute of Genetics, Molecular Medicine,University of Edinburgh

Summary

Describimos aquí un protocolo para investigar la citotoxicidad de CD8 pre-activado+ T las células contra las células cancerosas mediante la detección de apoptosis cáncer células vía en tiempo real la microscopia. Este protocolo puede investigar los mecanismos detrás de la supresión de la célula de T inducida por la célula mieloide y evaluar compuestos destinados a reposición de T las células vía bloqueo de células mieloides supresores inmunes.

Abstract

Potenciación de la capacidad de matanza de tumor de CD8+ T las células en los tumores, junto con la infiltración del tumor eficiente, es un elemento clave de éxito inmunoterapias. Varios estudios han indicado que el tumor mieloide células de la infiltración (por ejemplo, las células supresoras mieloides derivados (MDSCs) y los macrófagos asociados a tumor (TAMs)) inhiben citotoxicidad de CD8+ T las células en el microambiente del tumor y que orientación Estas células mieloides reguladoras pueden mejorar las inmunoterapias. Aquí, presentamos un sistema de ensayo in vitro para evaluar efectos supresivos inmunes de monocytic MDSCs y TAMs en la capacidad de matanza de tumor de CD8+ T las células. Para ello, primero nos cultivadas ingenuo CD8 esplénico+ T con anti-CD3/CD28 activación anticuerpos de las células en la presencia o ausencia de las células supresoras y luego Co cultivadas las células T previamente activadas con células de cáncer blanco en presencia de un fluorógenos sustrato de caspasa-3. Fluorescencia del substrato en las células de cáncer fue detectada por microscopía de fluorescencia en tiempo real como indicador de células T inducida por apoptosis de las células tumorales. En este ensayo, podemos detectar con éxito el aumento de la apoptosis de las células tumorales por CD8+ T las células y su represión por la cultura con TAMs o MDSCs. Este análisis funcional resulta útil para la investigación de CD8+ T celular mecanismos de supresión de las células mieloides reguladoras y identificación dianas druggable superar mediante proyección de alto rendimiento.

Introduction

Se conoce que CD8+ T las células pueden eliminar las células tumorales cuando ejercen su citotoxicidad completa. Después de la activación del receptor de la célula T (TCR), CD8+ T las células proliferan y se diferencian en células efectoras citotóxicas. El CD8 activado y ampliado+ T las células secretan gránulos citotóxicos, incluyendo perforin y granzymes, que se transfieren a las células diana e iniciar diversas vías líticas como la caspasa-3 mediada por apoptosis1. CD8+ T las células también pueden inducir apoptosis de las células tumorales mediante la activación de receptores en las células diana, como los receptores para el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), apoptosis primera señal de ligand (FasL), o ligando induciendo apoptosis relacionado con TNF (TRAIL). Además, el CD8 activados+ T las células secretan interferón-γ (IFN-γ) que puede suprimir la proliferación de células del tumor y aumentar la sensibilidad de las células del tumor a CD8+ T las células a través de la para arriba-regulación de FasL del receptor1. Dado el potencial para CD8+ T capacidad de matanza de tumor, varias estrategias para aumentar su citotoxicidad (p. ej., inhibidores de checkpoint, vacunación de cáncer y transferencia adoptiva de receptor antígeno quimérico (coche) expresando las células T) se han establecido y demostrados efectos terapéuticos significativos en ciertos tipos de cáncer2. Sin embargo, la acumulación de pruebas sugiere que inmune tumor infiltrante de células como las células T reguladoras supresoras mieloides derivados de las células (MDSCs) y los macrófagos asociados a tumor (TAMs) pueden suprimir CD8+ T funciones de la célula y restringir la eficacia las inmunoterapias3,4,5. Para mejorar estas inmunoterapias, es importante entender cómo inmune límite de células supresoras CD8+ citotoxicidad de células T. La identificación de CD8+ T celular mecanismos de supresión así como dianas druggable para superarlo, se requiere el desarrollo y la utilización de ensayos in vitro.

El método estándar de medición CD8+ citotoxicidad de células T es el ensayo de liberación de cromo en el que el lanzamiento de la sonda radiactiva (51Cr), del destino de las células que están sometidas a lisis por CD8+ T las células, determinado6. Sin embargo, este ensayo tiene varios inconvenientes, incluyendo la relativamente baja sensibilidad, euforia, incapacidad para detectar eventos apoptóticos tempranos, problemas de disposición peligrosa y limitada compatibilidad con automatizado manejo de líquidos y detección para apoyar aplicaciones de mayor rendimiento. Otro método común es análisis de citometría de flujo en que apoptosis de las células del tumor blanco es detectado por anexina V enlace7. En este ensayo, es posible detectar otros parámetros tales como la muerte de la célula objetivo utilizando yoduro de propidio (PI) o 7-aminoactinomycin D (7-AAD) y activación de células efectoras indicada expresión CD107a o CD69, además de la apoptosis en las células diana7 . Sin embargo, este análisis requiere gran cantidad de células supresoras en comparación con el ensayo de liberación de cromo. También requiere de la separación y disgregación de las células blanco adherente y esto puede sesgar los resultados. En efecto, el cromo liberan ensayo o análisis cytometric del flujo no se utilizan comúnmente para investigar efectos en células en funciones de la célula T supresora. En cambio, la medición de la proliferación de células T indicada por dilución de un colorante fluorescente (p. ej., CFSE) pre-cargado en las células de T se utiliza con frecuencia para evaluar la inhibición de CD8+ función de la célula de T por las células supresoras. Detección de la producción de IFN-γ de células T cultivadas es otro método estándar para evaluar los efectos de las células supresoras sobre la activación de células T8,9. Sin embargo, los resultados de estos ensayos no necesariamente se correlacionan a la celda de destino matando capacidad de CD8+ T las células.

Aquí presentamos un análisis funcional alternativa para evaluar los efectos de las células supresoras, particularmente macrófagos en tumores metastásicos, en la citotoxicidad de CD8+ T las células. Este método determina la citotoxicidad de CD8+ T células, previamente cultivadas con o sin las células supresoras en la presencia de anticuerpos de anti-CD3/CD28 activadoras, mediante la detección de apoptosis de las células tumorales, indicaron por la fluorescencia de un fluorógenos caspasa-3 substrato6 usando había automatizado de microscopia Time-lapse (figura 1). Este protocolo tiene varias ventajas en comparación con otros métodos; se requiere sólo un pequeño número de células, permite la detección de muerte celular, tumor adherente con alta sensibilidad, puede imagen interacción efectora a destino en tiempo real y susceptible de proyección de alto rendimiento.

En el presente Protocolo, los macrófagos asociada a metástasis (MAMs) y sus progenitor monocítica-MDSCs (M-MDSCs) aisladas de tumores metastásicos en los ratones se utilizan como células supresoras. En modelos de ratón de cáncer de mama metastásico, una población distinta de macrófagos caracterizado como F4/80altaLy6G–CD11baltabaja Ly6C se acumula en el pulmón con tumores metastásicos. Esta población de macrófagos es encontrada con frecuencia en el pulmón normal y así llamada de los macrófagos asociada a metástasis (MAMs)10. En estos modelos de ratón, otro mieloide célula población, definido como F4/80altaLy6G–CD11baltaLy6Calta, también se acumula predominantemente en el pulmón metastático donde da lugar a MAMs11. Basado en sus características, el CD11baltaLy6Calta MAM células progenitoras podrían representar MDSCs M12.

Protocol

Todos los procedimientos de ratones que se llevaron a cabo de acuerdo con la licencia permiso de Reino Unido Ministerio del interior (P526C60B3). Información sobre reactivos comerciales y equipos se enumeran en la Tabla de materiales. 1. preparación de las células Diana que expresan proteína fluorescente roja en sus núcleos Obtener una línea de células de cáncer de ratón blanco de una fuente adecuada.Nota: En el presente Protocolo, se utiliza un derivado altamente metastático de E0771 ratón tumor mamario células (LG E0771)13 . Los padres E0771 células originan de ratones C57BL/614. Descongelar y mantener un vial de células E0771-LG con de Dulbecco modificado águilas medio (DMEM) incluyendo 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) en una incubadora de cultivo celular en 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO2.Nota: Se debe confirmar que las células son negativas para mycoplasma. Con este fin, la cultura E0771 células (o probar) por 2-3 días como se describió anteriormente (en la ausencia de antibióticos y antimicóticos), recoger 500 μL de medio de cultivo. Centrifugar el medio a 12.419 x g durante 60 s para eliminar los restos celulares y transferir sobrenadante a tubos nuevos. Determinar contaminación por micoplasma utilizando un kit de prueba de mycoplasma comercialmente disponibles (consulte la Tabla de materiales) o PCR15 siguiendo las instrucciones del fabricante. Células por pocillo en una placa de 12 pozos y la cultura que las células con 10% FBS-DMEM (v/v) durante la noche en una incubadora a 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO2en semilla 5 x 103 E0771-LG.Nota: Si es baja la tasa de proliferación de las células diana (población mayor de 36 h de tiempo de duplicación), el número de células puede aumentarse a 1 x 104. Reemplazar el medio con 1 mL de 10% (v/v) FBS-DMEM incluyendo 10 polibreno μg/mL y añadir 25 μL de partículas lentivirales (1 x 10 6/mL TU) codificación una nuclear restringido proteína fluorescente roja (mKate2, consulte la Tabla de materiales). Cultura de las células durante 24 horas en una incubadora a 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO2. Reemplazar el medio con 10% (v/v) FBS-DMEM y cultura las células durante 24-48 h en una incubadora a 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO2. Reemplazar el medio con 10% (v/v) FBS-DMEM incluyendo 1 puromicina μg/mL, cuando las células comienzan a expresar la proteína fluorescente roja y las células de la cultura hasta los 80-90% confluente.Nota: Concentración de puromicina será diferente entre tipos de la célula diana y debe optimizarse mediante células transfected sin. El sobrevivir las células 1-3 entradas con 10% (v/v) FBS-DMEM incluyendo 1 puromicina μg/mL y criopreservar las existencias en un sistema de almacenamiento de fase de vapor de nitrógeno líquido hasta su utilización. 2. aislamiento de las células supresoras de tumores en ratones Nota: En el presente Protocolo, las células supresoras (es decir, MAMs y M MDSCs) están aisladas del pulmón con tumores metastásicos por células E0771-LG. Condiciones para la disociación del tejido y célula clasificación deben optimizarse para aislar las células de diferentes tejidos. Inyecte 1 x 106 células de cáncer (E0771 LG) en la vena de la cola de syngeneic (C57BL/6), ratones hembras, de 7-10 semanas de edad. Después de 14 días, aislar el pulmón con tumores metastásicos y preparar suspensiones unicelular de los pulmones perfundidos a través digestión enzimática como se describió anteriormente11.Nota: En el presente Protocolo, cuatro ratones son inyectadas con células de cáncer y sus pulmones metastásicos se combinan para obtener suficientes células supresoras. Incubar las suspensiones celulares solo con el anticuerpo de anti-ratón CD16/CD32 por 30 min en hielo y tinción con anticuerpos fluorescentes para CD45, F4/80, CD11b, Ly6C y Ly6G (véase Tabla de materiales) para otro 30 min10,11 , 13. Lavar las células una vez con 1 mL de PBS con un 2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) y Resuspenda el sedimento celular con 500-1000 μL de PBS con un 2% (w/v) BSA. Añadir 3 μM de DAPI y tipo M-MDSCs (CD45 DAPI–+F4/80+Ly6G–CD11baltaLy6Calta) y MAMs (CD45 DAPI–+F4/80+Ly6G–CD11balta Ly6Cbaja) utilizando un clasificador de células (figura 1 complementaria).Nota: El umbral de Ly6C nivel, MAMs (Ly6Cbaja) y M-MDSCs (Ly6Calta) se basa en los macrófagos alveolares residente (RMAC). La pureza de las células ordenadas se mide por citometría de flujo con una pureza esperada de más del 90%. Resuspender las células clasificadas con 400 μL de DMEM con 20% (v/v) FBS, penicilina/estreptomicina de 1% (v/v), 2 mM L-glutamina, 1% (v/v) no esenciales aminoácidos, piruvato de sodio 1 mM y 50 nM 2-Mercaptoetanol (llamado DMEM enriquecido, E-DMEM). Contar el número de células vivas usando la exclusión azul de tripano método16 y ajustar a 2 x 106 células/mL con E-DMEM. Mantener las células en hielo hasta su uso. 3. aislamiento de CD8+ T de las células del bazo de ratones Aislar el bazo de un ratón que es syngeneic para la línea de células de cáncer de blanco (es decir, C57BL/6 ratones en este protocolo) como sigue: Eutanasia animal por inhalación de CO2 . Coloque el animal en una mesa de disección limpia y limpie la piel con etanol al 70% (v/v). Cortar la piel abdominal con unas tijeras para exponer el bazo Aislar el bazo, que se encuentra inferior al estómago, y lo coloca en un tubo que contenga 5 mL de PBS helado. Utilizando el émbolo interior de una jeringa de 5 mL estéril, moler el bazo en un colador de celda de 100 μm en un tubo de 50 mL. Pasar las células a través del filtro total 10 ml de PBS. Centrifugue la suspensión de células a 337 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con EDTA 2 mM y 0,5% (p/v) de BSA (con búfer) y filtrar a través de un tamiz de 40 μm celular. Contar el número de células vivas y ajustar a 1 x 108 células/mL con el buffer de corriente.Nota: Mantenga una pequeña alícuota de células como una muestra de enriquecimiento previo para un control de pureza. Enriquecer para CD8+ T las células usando un kit de selección negativa y un compaginador magnético (consulte la Tabla de materiales). Transferencia de 1 x 108 (1 mL) de las células esplenocitos a un tubo de fondo redondo poliestireno de 5 mL. Añadir 50 μL de anticuerpos biotinilados e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Añadir 125 μL de conjugado estreptavidina granos magnéticos e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Añadir 1,325 mL de buffer de corriente y suavemente mezclar mediante pipeteo. Coloque el tubo en el imán e incubar a temperatura ambiente durante 2,5 min. Coge el imán y verter la suspensión enriquecida de células en un tubo nuevo. Resuspender las células enriquecidas con 200 μL de DMEM E (es decir., DMEM con 20% (v/v) FBS, penicilina/estreptomicina de 1% (v/v), 2 mM L-glutamina, 1% (v/v) no esenciales aminoácidos, piruvato de sodio 1 m m y 50 nM 2-Mercaptoetanol). Contar el número de células vivas y ajustar a 2 x 106 células/mL con E-DMEM. No las células a 37 ° C en CO2 incubadora hasta su uso.Nota: Mantenga una pequeña alícuota de células como una muestra de enriquecimiento después de un control de pureza. Determinar la pureza del CD8+ T las células mediante citometría de flujo como sigue: Tomar 1 x 104 células del enriquecimiento previo (paso 3.6) o muestras de enriquecimiento posterior (paso 3.9) y ajustar el volumen total de cada uno 100 μL utilizando buffer de corriente. Incubar las suspensiones celulares solo con el anticuerpo de anti-ratón CD16/CD32 por 30 min en hielo y tinción con anticuerpos fluorescentes para CD45, CD3, CD4 y CD8 (consulte la Tabla de materiales) por otros 30 minutos. Lavar las células con 500 μL de PBS con un 2% (w/v) BSA y Resuspenda el sedimento celular con 500-1000 μL de PBS con un 2% (w/v) BSA. Añadir 3 μM de DAPI y determinar el porcentaje de CD3+CD4–CD8 células+ en el CD45 total+ población de la célula. 4. activación y expansión de los CD8 aislados+ T células Alícuota 1 x 105 células por μL 50 CD8+ T células (preparadas en el paso 3.9) en los pocillos de una placa de fondo U 96 pocillos. Añadir 1 x 105 células por 50 μL las células supresoras (preparadas en el paso 2.7) o 50 μL de DMEM E en los pozos. Preparar el medio de la activación que consiste en E-DMEM, 4 x 104 factor estimulante de colonias U/mL 1 (CSF-1), 240 U/mL la interleucina-2 (IL-2), 8 μg/mL contra ratón CD3ε anticuerpo y 16 μg/mL anti-ratón anti-CD28.Nota: CSF-1 no es necesario para la activación de células T, pero es esencial para la supervivencia de las células supresoras en este protocolo (es decir, MAMs y M MDSCs). Así, se conserva en el co-cultivo de células T con células de cáncer blanco para mantener la uniformidad en condiciones de cultivo. CSF-1 se encuentra en concentraciones nano-molar en todos los tejidos y es necesaria para la viabilidad de monocito/macrófago en vivo, este es un contexto fisiológico para estas células. Añadir 50 μL de medio de activación (paso 4.3) y 50 μL de DMEM E con o sin reactivos para ser probado. Coloque la placa en una incubadora a 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO2 y la cultura de las células durante 4 días. 5. configuración de la cultura de destino de las células con CD8 pre-activado+ T células Añadir 30 μL de matriz de membrana basal soluble reducido factor de crecimiento diluida 1: 100 (Tabla de materiales) en los pocillos de la placa de 96 pocillos de fondo plano adecuado para microscopía e incubar a 37 ° C en un incubador de CO2 durante al menos 1 h. Preparar las células de la blanco (es decir, E0771 LG las células expresan la proteína fluorescente roja nuclear restringido). Incube las células blanco con 1 mL de 0.05% tripsina/EDTA a temperatura ambiente durante 1 min y cosechar las células mediante pipeteo suave. Añadir 9 mL de DMEM incluyendo 10% FBS (v/v) y Centrifugue la suspensión de células a 337 x g durante 5 minutos. Resuspender las células con 500 μL de DMEM E y cuente el número de células vivas.Nota: Antes de contar las células blanco, filtro de las células a través de un colador de los 40μm celular para producir la suspensión de células individuales. Ajustar la densidad a 2 x 104 células/mL (= 1 x 103 células por μL 50) mediante la adición de E-DMEM y mantener las células en hielo. Preparación de células efectoras (es decir, previamente activado CD8+ T las células). Resuspender las células en un pozo de placa de 96 pocillos (paso 4.5) bien por pipeteado y la transferencia de los CD8 flotante+ T las células en un nuevo tubo de 1,5 mL.Nota: MAMs M MDSCs firmemente se adhieren al pozo y no se extrae por el pipeteo. Para recoger las células restantes, añadir 200 μL de PBS en el pozo y transferir al tubo de paso 5.3.1. Lavar las células con 1 mL de E-DMEM una vez (centrífuga a 337 x g) durante 5 minutos, aspirar y descartar sobrenadante) y resuspender con 100 μL de DMEM E. Contar el número de células vivas (usando el método de exclusión del azul tripán), ajustar la densidad a 1.6 x 105 células/mL (= 4 x 103 células/25 μL) y mantener las células en hielo. Aspirar la matriz de la membrana basal de cada pocillo de la placa en el paso 5.1. Añadir 1 x 103 células/50 μL de las células diana (paso 5.2.4) en cada pozo y mezclar bien.Nota: Para evitar efectos de borde debido a la evaporación del medio, sólo el interiores 60 pozos, de los 96 bien placa debe utilizarse para el análisis. Añadir 25 μL de DMEM de E incluyendo 4 x 103 U/mL IL-2 y sustrato de caspasa-3 fluorógenos 10 μM (véase Tabla de materiales). Añadir 4 x 103 células/25 μL de CD8+ T células (paso 5.3.4) en caso de pozos y mezcle bien.Nota: La presencia de muchas células en un pozo hace el análisis más difícil. En este modelo, un efector de 4:1: relación de objetivo (celda total número 5 x 103 células/pocillo) era óptima, pero una relación 8:1 era subóptima. Pozos que contienen los cuatro controles siguientes son necesarios para ayudar con el análisis de datos: destino de las células a la densidad utilizada para los pozos de cocultivo (1 x 103 células/pocillo) en medio con y sin sustrato de caspasa-3, células efectoras (1 x 103 células / bien) en el medio con y sin sustrato de caspasa-3. Añadir 200 μL de PBS o agua estéril en todos los pocillos vacíos (especialmente pozos en la periferia de la placa) para reducir la evaporación del medio de los pozos experimentales. Coloque la placa en un microscopio de fluorescencia Time-lapse que se mantiene a 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO2.Nota: Agitar la placa en forma de cruz para distribuir a todas las células y luego deje que la plancha permanezca a temperatura ambiente sobre una superficie plana para 10-20 min antes de transferir a la incubadora. 6. la proyección de imagen de las células Nota: Imagen detallada adquisición configuración variará con el microscopio y fluoróforos utilizado; los siguientes parámetros de adquisición general deben emplearse para obtener resultados óptimos. Con una rutina adecuada de enfoque automático en el microscopio, adquirir imágenes que cubren al menos el 25% de la superficie total en cada pozo experimental de la placa de 96 pocillos. Ajustar el microscopio para adquirir imágenes en contraste de fases, así como un canal fluorescente adecuado para la nuclear restringido rojo proteína fluorescente (mKate2) y un canal fluorescente adecuado para fluorógenos verde activado sustrato de caspasa-3 (con excitación a 488 nm) (figura 2). Capturar imágenes en pozos experimentales en contraste de fase y los 2 canales fluorescentes cada 1 a 3 h durante al menos 72 h. 7. Análisis de la imagen utilizando el software de análisis de imagen Nota: Imagen detallada análisis configuración varía según el software utilizado (véase Tabla de materiales); los procedimientos de análisis general que se emplearán para obtener resultados óptimos. Determinar si espectral sin mezcla se requiere para separar la señal fluorescente emitida por los núcleos de célula blanco de que emitida por los núcleos apoptóticos y si es necesario, establece un protocolo de análisis para lograr esto; Ver un pozo de control que contiene solamente las células objetivo (denominada mkate2) en medio sin sustrato de caspasa-3 en el canal verde fluorescente. Observar si se emite fluorescencia verde por el rojo núcleos (los núcleos aparecen verdes) Fluorescencia verde es evidente en los núcleos, acceder al control de unmixing espectral en el software de proyección de imagen y aumentará el porcentaje de rojo extraído de verde hasta que desaparezca la señal verde (en nuestra experiencia, es generalmente 6-7% de mKate2 brillante fluorescencia). Fluorescencia verde no aparente en ningún núcleo, no unmixing espectral es necesario.Nota: Esta prueba de corrección unmixing espectral puede también llevarse a cabo utilizando una fuente de células Diana en medio que contiene sustrato de caspasa-3. Sin embargo, suele haber un nivel muy bajo de la apoptosis espontánea en las células diana (menos del 10%), resultando en unos núcleos de célula blanco emite fluorescencia verde debido a la activación de caspasa-3 en lugar de fluorescencia sangrado a través de. Purga de fluorescencia verdadera a través es evidente en estas condiciones cuando fluorescencia verde es evidente en todos los núcleos. Ver individualmente un control bien con las células efectoras única (núcleos sin etiqueta) en medio sin sustrato de caspasa-3 en el canal rojo y verde. Observar si los núcleos se emite fluorescencia verde o rojo. Si la fluorescencia ni rojo ni verde es evidente en los canales individuales no unmixing espectral es necesario.Nota: en nuestra experiencia, el ratón CD8+ T las células no son auto-fluorescentes y así no unmixing espectral es necesario para estas células. Esta prueba de corrección unmixing espectral también puede realizar usando un pozo de células efectoras en medio que contiene sustrato de caspasa-3. Sin embargo, suele haber cierto nivel de apoptosis espontánea en los núcleos de célula efectora emiten fluorescencia verde debido a la activación de caspasa-3. Purga de fluorescencia verdadera a través es evidente en estas condiciones cuando fluorescencia verde es evidente en todos los núcleos. Utilizar un método de sustracción de fondo fluorescencia (p. ej., TopHat), con parámetros relevantes para la muestra, para resolver los objetos fluorescentes en ambos canales fluorescentes.Nota: En el canal verde hemos utilizado el TopHat (radio núcleos = 10.0 μm, verde fluorescencia umbral = 0,7 unidades de calibración verde). En el canal rojo hemos utilizado el TopHat (radio núcleos = 10.0 μm, rojo fluorescencia umbral = 0,5 unidades de calibración rojo). Utilizar parámetros adecuados para la separación de borde para resolver núcleos fluorescentes individuales.Nota: No utilizamos borde partir en el canal de fluorescencia verde o rojo. Utilizar imágenes en el canal rojo de los pozos que contienen solamente las células diana (con sustrato de caspasa) para determinar el tamaño mínimo de núcleos blanco.Nota: Se utilizaron 80 μm2. Utilizar imágenes en el canal verde de los pozos que contienen sólo células efectoras (con sustrato de caspasa) para determinar el tamaño medio de los núcleos effector apoptotic.Nota: Solo núcleos de effector apoptotic oscilan entre 40 – 80 μm2 en estos experimentos. Establecer un procedimiento de análisis para contar el número de núcleos de célula blanco fluorescente con una restricción de tamaño mínimo adecuado (por ejemplo, área mínima, diámetro mínimo) (figura 2, máscara de detección de objetivo).Nota: Se utilizó un área mínima de núcleos (fluorescencia roja) = 80 μm2. Establecer un procedimiento de análisis para contar el número de núcleos apoptóticos que son más grandes que el tamaño medio de los núcleos effector apoptotic (figura 2, mascarilla de tamaño restringido de apoptosis).Nota: El filtro de tamaño se estableció a 80 μm2 (es decir, únicas áreas de fluorescencia verde más grande que este contaron, excluyendo así núcleos de effector apoptotic sola ). Utilizando estos parámetros aumenta la precisión del análisis en el conteo de núcleos de célula apoptótica blanco aunque algunos agregados de las células effector apoptotic pueden ser contados. Establecer un procedimiento de análisis para contar el número de las células diana de apoptotic contando núcleos donde la señal fluorescente roja (de paso 7.6) y la señal fluorescente verde tamaño restringido (desde el paso 7.7) significativamente co localización (figura 2, R Máscara de superposición/g).Nota: Una adecuada localización Co puede variar desde 30% hasta el 100% de la talla media de los núcleos de la blanco. Filtro de tamaño de superposición fue fijado a 40 μm2. Determinar el número de núcleos de célula apoptótica objetivo, así como el número de núcleos de célula de la blanco en los pozos para cada condición experimental a lo largo de todo el tiempo. 8. análisis usando el cálculo y representación gráfica de software Gráfica el número de núcleos de célula apoptótica destino obtenido en el paso de 7,9 a lo largo de todo el tiempo para los pozos experimentales. Si se utilizan varios pozos para cada condición experimental, presentan gráficamente los resultados como media ± desviación estándar. Calcular la fracción de apoptosis de la población de células blanco al dividir el número de células apoptóticas en cada pozo por el número de células diana de cada bien en cada momento. Graficar los resultados obtenidos en el paso 8.2. Determinar el área bajo la curva (AUC) para cada curva. La fracción de apoptotic de pico de la población para cada curva puede determinarse también así como el momento en que se produce el pico, si lo desea. Determinar si las AUC determinada para las condiciones experimentales son significativamente diferentes, usando pruebas estadísticas apropiadas.Nota: La prueba de t no pareada con corrección de Welch fue aplicada a los resultados AUC.

Representative Results

Este método se basa en simple cocultivo de células de cáncer blanco con efectores CD8+ T las células que previamente cultivadas con o sin células supresoras en la presencia de anti-CD3/CD28 activación anticuerpos. Detecta CD8+ apoptosis de las células cáncer inducido por la célula de T en el tiempo siguiendo la cultura, lo que permite la evaluación de los efectos de las células supresoras sobre la citotoxicidad de CD8+ T las células. Normalmente, las células de cáncer aumentan fluorescencia verde en sus núcleos tras la activación de un biosensor de caspasa nucleares dirigidos a cuando estas células hacen contacto con CD8+ T de las células que pre-se activan por los anticuerpos en ausencia de (células) supresor Figura 3; Película adicional 1). Fluorescencia verde desde el sustrato de caspasa era perceptible durante al menos 15 h después de apoptosis fue iniciada. Algunos apoptosis espontáneo de efectores CD8+ T las células también se ha observado con el tiempo incluso si estas células fueron cultivadas en el aislamiento (figura 4; Película adicional 2). Sin embargo, los tamaños de núcleos de CD8+ T las células son más pequeñas que las de las células cancerosas y así las células apoptotic ‘effector’ pueden ser excluidas de apoptotic recuentos celulares ‘objetivo’ por un tamaño restricción imagen método de análisis (figura 2 y figura 4). Aunque algunas células de cáncer de destino muestran una pequeña forma redondeada sin fluorescencia verde, esto no afecta el análisis de estas células experimentan mitosis en vez de apoptosis (adicional 3 de la película), y así están excluidas apoptotic ‘target’ la célula cuenta con una máscara de la superposición del rojo y verde (suplementario Figura 2). Apoptosis espontáneo de las células de cáncer blanco se encuentra de vez en cuando incluso en la cultura única (adicional 3 de la película). Sin embargo, la cultura Co de cáncer blanco células con CD8 pre-activado+ T células apoptosis de las células tumores aumentado por encima de los niveles de apoptosis espontánea en monocultivo de las células cancerosas (figura 4). Generalmente, cuando se utiliza una proporción óptima de las células cancerosas objetivo a células efectoras, un pico en el número de células de cáncer apoptosis blanco puede observarse (figura 5A). Este pico es más distinta cuando los datos se expresaron como la fracción de apoptosis de la población de la célula (figura 5B). En este experimento el basal apoptosis de las células del tumor blanco alcanzó su punto máximo a las 24 h (con fracción de apoptotic = 0.08), pero CD8+ apoptosis inducida por células T alcanzó un nivel máximo a las 17 h (con fracción de apoptotic = 0.66). Encontramos más que CD8+ T células previamente incubadas con MAMs o M-MDSCs podrían hacer contacto con las células de cáncer blanco pero este contacto parece resultar en menos casos de cáncer apoptosis de las células en comparación con el CD8+ T células previamente activación sin células supresoras (figura 3 y figura 4; Película adicional 4 y complementaria Movie 5). Aunque el CD8+ T las células pre incubadas con las células mieloides en ocasiones inducida por apoptosis de células de cáncer, había también cierta proliferación de las células de cáncer de Diana que no han sido estimulado a sufrir apoptosis durante el curso del tiempo el experimento (adicional 6 de la película). De acuerdo con estos resultados, la fracción máxima de las células de cáncer de apoptotic cultivadas con CD8+ T células incubaron previamente con células mieloides (apoptotic fracción = 0.38 a las 23 h para CVE-E y 0,25 a las 20 h para MAM-E) fue significativamente menor que la de las células cancerosas cultivadas con CD8+ T las células que no fueron previamente incubados con las células supresoras (figura 6). Figura 1: un esquema que muestra el procedimiento experimental. Ingenuo esplénico CD8+ T las células se cultivan con anti-CD3/CD28 activación anticuerpos con o sin los macrófagos asociada a metástasis (MAMs) o supresor de monocytic mieloide-derivados de las células (M-MDSCs). Después de 4 días, flotante CD8+ T las células son recogidas y cultivadas conjuntamente con las células de cáncer blanco en presencia de sustrato de caspasa-3 fluorógenos. Se detectan células de cáncer apoptosis bajo microscopía de fluorescencia en tiempo real. Imágenes que se muestran fueron adquiridos mediante una plataforma de proyección de imagen de la célula viva (véase Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: identificación de las de células apoptotic destino distintas de las células effector apoptotic. Adquisición de imagen: fila de arriba en el canal rojo permite la identificación de núcleos de célula del objetivo por objetivo detección mascarilla (análisis rosa). Fila del medio: imágenes adquiridas en el canal verde indican apoptotic células efectoras y de destino. Asize apoptosis restringido máscara (máscara análisis teal; más de 80 μm2) permite solo apoptotic células efectoras a ser excluidos del análisis. Fila inferior: compuesto de imágenes combinado rojo y verdes canales con imagen de contraste de fase (izquierda) o rojo/verde superponen máscara (derecha). Identificación de fluorescencia verde Co localizada, tamaño restringido con fluorescencia roja (máscara de análisis amarillo), permite una detección más precisa de la apoptosis núcleos blanco (flecha amarilla) excluyendo agregados de apoptotic células efectoras (blanco puntas de flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Interacción entre CD8+ T las células y las células cancerosas. Fotogramas de películas representativas Time-lapse de las células de blanco E0771-LG_NLR (T) cultivadas conjuntamente con efectores CD8+ T las células (E) en proporción de 4:1 generador de efectos y destino. CVE-E y MAM E indican células efectoras previamente incubaron con MDSCs M y MAMs respectivamente. Se muestran imágenes compuestas (incluyendo imágenes de los canales de fase contraste, rojo y verde). Puntas de flecha son el seguimiento de las mismas células a través de los diferentes ámbitos y momentos. Amarillo las puntas de flecha: un objetivo que asocia a efectores y experimenta apoptosis, blancas las puntas de flecha: un objetivo que se asocia con efectores no sufre apoptosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: detección de las células de cáncer de apoptotic. Campos representativos extraídos de películas Time-lapse a las 18 h después de la proyección de imagen. Imágenes compuestas (izquierda; canales de fase contraste, rojo y verde) y las imágenes del rojo del canal sin (medio) o con superposición de rojo y verde (derecha) se muestran máscara (amarillo). Puntos amarillos en la columna derecha representan las células de cáncer apoptosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: CD8+ cáncer inducido por la célula de T de la célula apoptosis. (A) número de apoptosis las células cancerosas cultivadas con efector C8+ T células en diferentes efectores relación objetivo (e: t). apoptótica (B) fracción de la población de la célula blanco. Los datos son medio ± SD media área bajo la curva (AUC) también se muestra. Desapareado t-test con corrección de Welch se utilizó para analizar las AUC. * P < 0.0001 comparado con e: t = 0:1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Efectos de tumor infiltrante de células mieloides en la citotoxicidad de CD8+ T las células. (A) número de células de cáncer apoptosis (objetivo: T) con C8+ T células (efectores: E) en el 4:1 del cociente del e: t. CD8+ T células previamente fueron cultivadas en ausencia (círculo negro) o presencia de células monocytic mieloide-derivados de supresor (CVE-E: azul círculo) o macrófagos asociada a metástasis (MAM-E: círculo rojo). Datos son medio ± SD. (B) Apoptotic fracción de población de la célula blanco. Los datos son medio ± SD significa AUC también se muestra. Desapareado t-test con corrección de Welch se utilizó para analizar las AUC. * P < 0.0001 comparado con T, #P < 0.0001 comparado con E + T. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Suplementario Figura 1. Bloquea la estrategia para aislar a las células supresoras de pulmón metastásico. (A) representante punto parcelas para aislar las células supresoras mieloides derivados monocítica (M-MDSCs) y los macrófagos asociada a metástasis (MAMs). El umbral de Ly6C nivel, MAMs (Ly6Cbaja) y M-MDSCs (Ly6Calta) se basa en los macrófagos alveolares residente (RMAC). (B) pureza de las M-MDSCs ordenados (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Calta) y MAMs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cbaja). Haga clic aquí para descargar este archivo. Suplementario Figura 2. Imágenes representativas de las células mitotic blanco. Fotogramas de películas Time-lapse representante de E0771-LG_NLR celular mono-cultura. Arriba: imágenes compuestas incluyendo imágenes de los canales de fase contraste, rojo y verde. Abajo: imágenes compuestas (canales rojo y verdes) con la máscara de la superposición del rojo y verde. Haga clic aquí para descargar este archivo. Suplementario Figura 3. Efectos de la infiltración tumoral de las células mieloides en proliferación de CD8+ células T. (A) histogramas representativos mostrando dilución de etiquetado fluorescente con CFSE en CD8+ T las células. Ingenuo esplénico CD8+ T células fueron aisladas como se describe en el protocolo 3 y etiquetadas con 5 μm de CFSE a 37 ° C durante 15 minutos. Las células T etiquetadas fueron cultivadas en presencia de IL-2 y anti-CD3/CD28 activación de anticuerpos con o sin células mieloides como se describe en el protocolo 4. Después de 4 días, se detectó fluorescencia verde en las células de T por citómetro de flujo. (B) índice de división de CD8+ T células calcularon como se describió anteriormente17. Los datos son medios ± SEM. * P < 0.01 comparado con el control, #P < 0.05 comparado con αCD3/CD28 AB. haga clic aquí para descargar este archivo. Película complementaria 1. Película de figuras 3 y 4; E + T. Haga clic aquí para descargar este archivo. Película complementario 2. Película de figuras 3 y 4; Efectos (E). Por favor haga clic aquí para descargar este archivo. Película complementario 3. Película de figuras 3 y 4; Destino (T). Por favor haga clic aquí para descargar este archivo. Película complementaria 4. Película de figuras 3 y 4; CVE-E + T. Haga clic aquí para descargar este archivo. Película complementaria 5. Película de figuras 3 y 4; MAM-E + T. Haga clic aquí para descargar este archivo. Película complementario 6. Película de figuras 3 y 4; MAM-E + T (proliferación). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Este método se basa en dos pasos separados cocultivo: co-cultivo CD8 células+ T con potenciales células supresoras y co-cultivo CD8 ‘pre condicionada’+ T las células con las células diana tumorales (figura 1). El primer paso de la cultura es muy similar a la de CD8+ T célula ensayos de proliferación suele utilizados para determinar el efecto de las células supresoras en CD8+ función de la célula de T. Sin embargo, la proliferación de célula T no se correlaciona siempre con su citotoxicidad. Por ejemplo, hemos encontrado que co-cultivo con MDSCs M o MAMs aumentó en lugar de reducida proliferación de CD8+ T las células en presencia de CD3/CD28 activación de anticuerpos (figura 3 complementaria), mientras que éstos previamente acondicionado CD8+ Las células de T demostraron reducir la citotoxicidad contra células de cáncer blanco (figura 4, figura 5, figura 6). Estos resultados destacan la importancia de la evaluación de la actividad funcional, evidenciado por objetivo cáncer apoptosis de las células, por esta CD8+ ensayos de citotoxicidad en la célula de T.

En este ensayo, hemos identificado que CD8+ T las células requiere aproximadamente 15 horas de cocultivo para inducir apoptosis máxima de células de tumor mamario de ratón E0771-LG (figura 5). Este retraso puede ser debido a la diferencia entre el contacto inicial de células efectoras con objetivos y formación de sinapsis inmune que lo acompaña, así como tiempo requerido para inducir señales de apoptosis en objetivos según lo medido por la activación de caspasa-3 (complementaria 1 película ). Identificamos también que el número de las células tumorales apoptóticas alcanzó una meseta después de 24 h, que es probablemente debido a la eliminación de objetivos por las células T o pérdida de la señal fluorescente de células muertas. Esta capacidad para identificar el momento del pico de apoptosis es una ventaja importante de este ensayo puesto que la determinación de un punto de tiempo óptimo es importante para apropiado comparaciones entre diversas condiciones. En nuestro caso por ejemplo, la diferencia de citotoxicidad entre control CD8+ T las células y CD8 MDSC/MAM-educado+ T las células fue mucho mayor a 15-18 h en comparación con 72 h (figura 5), y así un extremo experimentar usando un período de incubación de 72 h resultados engañosos.

Este método también permite la visualización de la interacción de la célula efectora a destino en tiempo real, que proporcione mayor información sobre el mecanismo subyacente limitada citotoxicidad de CD8+ T las células pre-se incuban con las células supresoras. Por ejemplo, observamos que CD8+ T las células previamente incubadas con MDSCs M o MAMs encontró y obró recíprocamente con las células del tumor blanco pero siempre no indujo apoptosis (complementario Movie 4, complementario de película de 5 adicional 6 de la película). Aunque no se cuantificó este evento, sería factible e interesante para cuantificar y comparar la proporción de encuentros y su tiempo de interacción en correlación con la inducción de apoptosis. Otra gran ventaja es que este método requiere una pequeña cantidad de células (por ejemplo, 1 x 103 de blanco) y 4 x 103 células efectoras por pozo. De hecho, este protocolo puede ser más miniaturizado para el formato de la placa de 384 pozos si se desea. Por lo tanto, este análisis son conveniente para los experimentos y proyección de alto rendimiento donde el número de células es limitado como en vitro prueba con preciosas células derivadas in vivo o ex vivo muestras.

Por otro lado, una limitación del análisis actual es la presencia de un número significativo de células efectoras muertos en algunas condiciones. Con el fin de aumentar la precisión en la distinción de apoptosis de las células de cáncer blanco del de efectores CD8+ T de las células, los núcleos de blanco las células están marcadas y una restricción de tamaño (que excluye a las células efectoras) es aplicado para el análisis de los datos en este los núcleos ensayo (figura 2). Sin embargo, hay algunos casos donde las células de recubrimiento de los agregados de apoptosis (verde) CD8+ T en apoptosis no objetivo las células cancerosas, que pueden confundir los resultados. Esta limitación podría ser mitigada por el uso de una columna de eliminación de células muertas en antes de células efectoras de la cultura conjuntamente con las células del tumor blanco, asumiendo que hay un número suficiente de células efectoras. Con sistemas más complejos de la microscopía, también puede ser posible reducir la señal de positivo falso etiquetado efectoras CD8+ T las células con un fluoróforo distinto de los núcleos de la célula diana y el sustrato de caspasa-3 fluorógenos.

Hasta el momento, este protocolo se ha utilizado para investigar la activación no específica de antígeno de CD8+ T las células. Aunque MDSCs y TAMs en el microambiente del tumor suprimen funciones de las células T a través de mecanismos no específicos de antígeno, MDSCs en los tejidos linfoides periféricos inhiben las respuestas de la célula de T en una forma específica de antígeno18. Investigar funciones inmunitarias represivas de tales tipos de celulares, un ensayo de proliferación in vitro utilizando CD8 células+ T de OT-1 ratones transgénicos es de uso general. En este ensayo, las células de T de OT-1 (expresión del receptor de células T específicas de ovoalbúmina (OVA)) se cultivan conjuntamente con supresor MDSCs en presencia de péptidos de la OVA, que es aplicable para la primera cultura en nuestro análisis de citotoxicidad (es decir., la activación de T las células en la presencia o ausencia de supresores). También es factible manipular las células de cáncer de blanco para expresar óvulos, que pueden inducir la matanza de células de cáncer específica de antígeno por células T OT-1. Por lo tanto, el análisis también permitirá investigación de la represión MAM/MDSC-mediada de la activación de la célula T antígeno-específica. También es posible aplicar el análisis para investigar las células humanas, como activación de anticuerpos contra el CD3 y CD28 está comercialmente disponible, y un protocolo para aislar humanos TAMs de muestras clínicas ha establecido19.

Colectivamente, este ensayo es muy versátil y puede utilizarse para examinar la citotoxicidad de otros tipos de células inmunes. Actualmente, en nuestros laboratorios, se está extendiendo para examinar la citotoxicidad celular dependiente de antígeno en diversas condiciones y es también se están desarrollando para el alto rendimiento de detección.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) y MRC (Señor/N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC y DDS reconocen apoyo del fenotípicas de detección centro de Fenómica descubrimiento iniciativa nacional y de investigación de cáncer Reino Unido (NOC)

Materials

0.05% Trypsin EDTA (1X) Gibco 25300-054
12-Well Cell Culture Plate Freiner Bio-One 665-180
1x PBS Gibco 14190-094
2-mercaptethanol Sigma M6250-10ML
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube FALCON 352054
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) Costar 3799 Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells
96-well plate (Flat bottom) Nunc 165305 Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody BIO-RAD MCA497A647 Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1×10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody Biolegend 100730 Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1×10^6 cells
anti-mouse CD28 Antibody Biolegend 102111 Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e Antibody Biolegend 100314 Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100236 Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1×10^6 cells
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody Biolegend 128026 Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1×10^6 cells
Bovine Serum Albmin Sigma A1470-100G
Cell Strainer (100μm Nylon) FALCON 352360 To smash the spleen
Cell Strainer (40μm Nylon) FALCON 352340 To filter the lung digestion
DAPI Biolegend 422801
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium Gibco 41966-029
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell Technologies 19853
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106
FITC anti-mouse CD4 Antibody Biolegend 100406 Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1×10^6 cells
Geltrex Ready-to-Use Gibco A1596-01 Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent Essen BioScience 4476 Lenti viral particules encoding mKate2
IncuCyte ZOOM Essen BioScience Detector (fluorescence microscope)
IncuCyte ZOOM 2018A Essen BioScience Analysis software
L-Glutamine (100X) Gibco A2916801
Lung Dissociation Kit Miltenyi 130-095-927 Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza LT07-318
Non-essential amino acid (100X) Gibco 11140-035
NucView488 Biotium 10403 Fluoregenic caspase-3 substrate
PE anti-mouse Ly6G Antibody Biolegend 127607 Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1×10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody Biolegend 101216 Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1×10^6 cells
Pen Strep Gibco 15140-122 Penicillin Streptomycin for primary culture of cells
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody Biolegend 103132 Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1×10^6 cells
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma H9268
Puromycin Gibco A11138-03
RBC Lysis Buffer (10X) Biolegend 420301
Recombinant murine IL-2 Peprotech 212-12 Activation of isolated CD8+ T cells
Sodium pyruvate (100X) Gibco 11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend 101320
 : Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm)
 : Green channel excitation: 440 – 480 nm
 : Green channel emission: 504 – 544 nm
 : Red channel excitation: 565-605 nm
 : Red channel emission: 625 – 705 nm
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Referencias

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Kitamura, T., Doughty-Shenton, D., Pollard, J. W., Carragher, N. O. Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells. J. Vis. Exp. (143), e58841, doi:10.3791/58841 (2019).
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