CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出⁺ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

含むマウスに基づき実施されたすべての手順は、アクセス許可から英国ホーム オフィス (P526C60B3) をライセンスされています。市販試薬と機器については、材料表に表示されます。 1. 赤色螢光蛋白の核を表すターゲット細胞の調製 適切なソースからターゲットのマウス癌細胞株を取得します。注: このプロトコルの E0771 マウス乳腺腫瘍細胞 (E0771-LG)13の転移性の高い誘導体、使用されます。親の E0771 細胞は C57BL/6 マウス14に属します。 解凍し、維持の E0771-LG 細胞のバイアルとダルベッコ変更イーグルス媒体 (DMEM) 37 ° C、湿度 95%、および 5% CO2で細胞文化のインキュベーターで 10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS) を含みます。注: それ確認すべきセルがマイコ プラズマは陰性であること。このため、2-3 日培養液 500 μ L 収集 (で抗生物質とその結果がない場合)、上記のように E0771 セル (またはテストするセル) を文化します。60 12,419 x gで媒体を遠心分離機 s を細胞の残骸を除去し、新しいチューブに上清を移します。市販マイコ プラズマ検査キットを用いたマイコ プラズマ汚染を判断 (資料の表を参照) や PCR15製造元の指示に従います。 12 ウェル プレートに 10% (v/v) FBS DMEM で細胞が 37 ° C、湿度 95%、および 5% CO2でインキュベーターで一晩培養ウェルあたり種子 5 x 103 E0771 LG セルです。注: ターゲット細胞の増殖率が低い場合 (倍加時間 36 h より大きい)、1 x 10 の4セルの数を増やすことが。 1 ml の 10% (v/v) 10 μ g/mL polybrene を含む FBS DMEM 培地を交換し、レンチ ウイルス粒子 (1 x 106 TU/mL) の 25 μ L を追加赤色蛍光タンパク質を制限されて核のエンコーディング (mKate2、材料の表を参照してください)。 37 ° C、湿度 95%、および 5% CO2でインキュベーターで 24 時間培養します。 10% (v/v) FBS DMEM 培地を交換し、37 ° C、湿度 95%、および 5% CO2でインキュベーターで 24-48 時間培養します。 10% (v/v) FBS DMEM 細胞赤色蛍光タンパク質を表現し、彼らが 80-90% 合流まで、細胞の培養を開始するときに 1 μ g/mL ピューロマイシンを含む媒体を交換してください。注: ピューロマイシン濃度ターゲット セル型の間異なるだろうし、非 transfected セルを使用して最適化する必要があります。 10% (v/v) FBS DMEM 1 G/ml ピューロマイシンを含む 1-3 通路用存続のサブカルチャー、そして液体窒素の蒸気相ストレージ ・ システムで使用するまで株を凍結します。 2. マウスの腫瘍のサプレッサー細胞の分離 注: このプロトコルでサプレッサー細胞 (すなわちMAMs と M MDSCs)、E0771-LG セルによって確立された転移性腫瘍を含む肺から分離。組織解離・細胞のソーティングのための条件を最適化して、さまざまな組織から細胞を分離してください。 1 x 106癌細胞 (E0771-lg 電子) を同系 (C57BL/6)、女性、7-10 週古いマウスの尾静脈に注入します。 14 日後転移性腫瘍を含む肺を切り分け、前述11として酵素消化による灌流の肺から単一細胞懸濁液を準備します。注: このプロトコルで癌細胞が注入される 4 つのマウスと転移性肺が十分な抑制性細胞を取得する結合されます。 氷の上で 30 分間抗マウス CD16/CD32 抗体を用いた単一細胞懸濁液を孵化させなさい、別の 30 分10,11 CD45、F4/80、CD11b、Ly6C、および Ly6G (材料の表を参照) を蛍光抗体で染色,13。 1 mL の 2% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) を含む PBS で一度陽性細胞を洗浄し、再を 2% (w/v) BSA を含む PBS の 500-1000 μ l 細胞ペレットを中断します。 追加の DAPI、3 μ M および M MDSCs を並べ替え (DAPI-CD45+F4/80+Ly6G-CD11b高Ly6C高) と MAMs (DAPI-CD45+F4/80+Ly6G-CD11b高Ly6C低) セルソーター (補足図 1) を用いたします。注: MAMs (Ly6C低) と M-MDSCs (Ly6C高) を区別するために Ly6C レベルのしきい値は、肺胞マクロファージ (RMAC) のそれに基づいています。90% 以上の純度が予想される cytometry 流れを介して、細胞の純度を測定します。 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン, L-グルタミン, 1% (v/v) 非本質的なアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム 1 mM、2 mM と 50 nM 2-メルカプトエタノール (濃縮 DMEM、E DMEM と呼ばれる) を含む DMEM の 400 μ L で並べ替えられた細胞を再懸濁します。 トリパン ブルー排除法16を使用して生きているセルの数をカウントし、E DMEM に 2 x 106セル/ml に調整します。 使用するまで氷の上細胞を保ちます。 3. CD8 の分離マウスの脾臓から細胞の+ T 次のようにターゲット癌細胞株 (すなわち、このプロトコルでは c57bl/6 マウス) に同系マウスから脾臓を孤立させます。 CO2吸入によって、動物を安楽死させます。 きれいな郭清のボードに動物を置き、70% (v/v) アルコールで皮膚を拭きます。 脾臓を公開するはさみを使用して腹部の皮膚をカットします。 胃に劣ってある、脾臓を隔離し、5 mL の氷冷 PBS を含むチューブに入れます。 5 mL の滅菌注射器の内部のプランジャーを使用すると、50 mL のチューブに設定 100 μ m セル ストレーナーに脾臓を挽きます。 セルを合計 10 mL の PBS を使用してフィルターに通過します。 337 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心し、上清を吸引します。 1 mL の 2 ミリメートルの EDTA および 0.5% (w/v) BSA (実行バッファー) を含む PBS で細胞ペレットを再懸濁します、40 μ m セル ストレーナー フィルターします。 生細胞数をカウントし、実行中のバッファーを使用して 1 × 108セル/mL に調整します。注意: 小さな細胞分注前濃縮サンプル純度チェックとして。 CD8 の豊かな+ T 細胞の否定的な選択キットと磁力選別機を使用して (材料の表を参照してください)。 5 mL ポリスチレン丸底チューブに脾細胞細胞の 1 x 108 (1 mL) を転送します。 ビオチン化抗体の 50 μ L を追加し、10 分間室温でインキュベートします。 標識ストレプトアビジン磁気ビーズの 125 μ L を追加し、5 分間室温でインキュベートします。 連続したバッファー、1.325 mL を追加し、軽くピペッティングで混ぜます。 磁石にチューブを置き、2.5 分間室温でインキュベートします。 磁石をピックアップし、新しい管に濃縮細胞懸濁液を注ぐ。 E DMEM の 200 μ L に濃縮細胞を再懸濁します (すなわち.、 20% (v/v)、政府短期証券を含む DMEM 50 nM 2-メルカプトエタノール、1 mM ピルビン酸ナトリウム, 1% (v/v) 非本質的なアミノ酸 2 mM L グルタミン 1% (v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン)。 生きているセルの数をカウントし、E DMEM に 2 x 106セル/ml に調整します。おいてセル 37 ° C で CO2インキュベーター使用まで。注意: 小さな細胞分注後濃縮サンプル純度チェックとして。 CD8 の純度を決定する+ T 細胞のフローサイトメトリーによって次のように。 前濃縮 (ステップ 3.6) から 1 x 10 の4セルまたは後濃縮 (ステップ 3.9) サンプルを取るし、実行バッファーを使用して 100 μ L にそれぞれの総量を調整します。 氷の上で 30 分間抗マウス CD16/CD32 抗体を用いた単一細胞懸濁液をインキュベートし、別の 30 分の CD45、CD3、CD4 および CD8 (材料の表を参照) を蛍光抗体で染色します。 500 μ L の PBS を含む 2% (w/v) BSA の陽性細胞を洗浄し、再を 2% (w/v) BSA を含む PBS の 500-1000 μ l 細胞ペレットを中断します。 DAPI の 3 μ M を追加して、CD3 の割合を決める+CD4-CD8 合計 CD45 の細胞の+ +セルの人口。 4. 活性化と孤立した CD8 の拡大+ T 細胞 あたり 50 μ L 分注 1 x 10 の5セル CD8+ T U 下 96年ウェル プレートのウェルに細胞 (3.9 の手順で準備)。 (2.7 の手順で準備) 50 μ L サプレッサー細胞あたり 1 x 10 の5セルを追加または 50 μ L E DMEM の井戸に。 16 μ g/mL 抗マウス CD28 抗体、8 μ g/mL 抗マウス CD3ε 抗体、240 U/mL インターロイキン 2 (IL-2) 4 × 104 U/mL コロニー刺激要因 1 (CSF-1) E DMEM で構成される活性化メディアを準備します。メモ: CSF 1 T 細胞活性化には必要ありませんが、このプロトコル (すなわち、MAMs と M MDSCs) でサプレッサー細胞の生存に不可欠です。したがって、それは培養条件の整合性を維持するためにターゲット癌細胞と T 細胞の共培養で保持されます。CSF 1 ナノ モル濃度ですべての組織である、単球/マクロファージの生存率、体内に必要なために、これはこれらの細胞の生理学的なコンテキストです。 ライセンス認証メディア (手順 4.3) の 50 μ L を追加し、テストする試薬有無 E DMEM の 50 μ L。 37 ° C、湿度 95%、および 5% CO2で定温器にプレートを置き、4 日間培養します。 5. セットアップ ターゲットの共培養の細胞活性化 CD8+ T 細胞 顕微鏡検査に適した平らな底 96 ウェル プレートのウェルに 1: 100 希釈の成長因子低減水溶性基底膜マトリックス (材料表) の 30 μ L を追加し、37 ° c 少なくとも 1 時間のための CO2インキュベーターで孵化させなさい。 ターゲット細胞 (すなわち、E0771 LG 細胞核制限赤蛍光蛋白を発現する) を準備します。 1 ml 0.05% トリプシン/1 分間室温で EDTA の標的細胞をインキュベートし、穏やかなピペッティングにより細胞を収穫します。 10% (v/v)、政府短期証券を含む DMEM の 9 mL を追加し、337 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心分離します。 再を E-DMEM 500 μ l 細胞を中断し、生きているセルの数をカウントします。注: ターゲット細胞をカウントする前に、セルを単一細胞懸濁液を生成する 40μm セル ストレーナー フィルターします。 氷の上の細胞を維持し、E-DMEM を追加することによって 2 × 104セル/mL (= 50 μ L あたり 1 x 10 の3セル) に密度を調整します。 エフェクター細胞を準備 (すなわち、前の活性化 CD8+ T 細胞)。 + T ピペットと転送浮動 CD8 によって徹底的に 96 ウェル プレート (ステップ 4.5) の井戸に細胞が新しい 1.5 mL チューブに細胞を再懸濁します。注: MAMs と M MDSCs しっかりと井戸に付着し、ピペッティングではデタッチされません。 残りのセルを収集、井戸に PBS の 200 μ L を追加し手順 5.3.1 でチューブに移します。 5 分 1 ml E-DMEM 一度 (337 × gで遠心分離) のセルを洗浄、吸引、上澄みを廃棄) を 100 μ E DMEM のそれらを再停止しなさいと。 (トリパン ブルー色素排除法を使用して) 生きているセルの数をカウント、1.6 105セル/mL (= 4 × 103セル/25 μ L)、倍密度を調整し、氷の上の細胞を維持します。 手順 5.1 でプレートの各ウェルから基底膜マトリックスを吸い出しなさい。 各ウェルに標的細胞 (ステップ 5.2.4) の 1 x 103セル/50 μ L を加え、よく混ぜます。注: も、96 の内側 60 井戸のみ、中の蒸発によるエッジ効果を避けるためにプレートは解析に使用する必要があります。 4 x 103 U/mL IL-2 と 10 μ M 蛍光カスパーゼ 3 基板 (材料の表を参照) を含む E DMEM の 25 μ L を追加します。 CD8 の 4 x 103セル/25 μ L を追加+ T 細胞 (ステップ 5.3.4) に井戸を適切なよく混ぜます。注: 井戸にあまりにも多くの細胞の存在分析より難しくなります。このモデルでは、4:1 のエフェクター: ターゲット比率 (総セル数 5 × 103細胞/ウェル) が最適、8:1 の比率と思いました。次の 4 つのコントロールが含まれている井戸があるデータの分析を支援するために必要な: エフェクター細胞 (1 x 10 の3セル密度とカスパーゼ 3 基板なしは培地に培養井戸 (1 x 103細胞/ウェル) の使用で細胞を標的/よく) 中とカスパーゼ 3 基板なし。 実験井戸から培地の蒸発を減らすためには、すべて空井戸 (特にプレートの周囲に井戸) に 200 μ L の PBS または滅菌水を追加します。 37 ° C、湿度 95%、および 5% CO2で維持されるタイムラプス蛍光顕微鏡にプレートを設定します。注: すべてのセルを均等にクロス パターンのプレートを振るし、インキュベーターに転送する前に 10 〜 20 分のための平らな面に部屋の温度を維持するプレート。 6. 細胞のイメージング 注: 顕微鏡と蛍光物質の使用; 詳細な画像取得設定が異なります次の一般的な集録パラメーター最適な結果を得るべきであります。 顕微鏡を適切なオート フォーカス ルーチンを使用して、各実験ウェルの 96 ウェル プレートで総面積の 25% 以上をカバーする画像を取得します。 核制限の赤蛍光蛋白質 (mKate2) のための適した蛍光チャネルと同様に、位相コントラストの画像を取得する顕微鏡をセットし、緑の蛍光に適した蛍光チャネル活性化 (カスパーゼ 3 基板励起 488 nm) (図 2)。 位相差顕微鏡および少なくとも 72 時間のすべての 3 に 1 h 2 蛍光チャンネルで実験の井戸の画像をキャプチャします。 7. 画像解析画像解析ソフトを使用して 注: 詳細な画像分析の設定は使用するソフトウェアによって異なります (材料の表を参照してください)。次の一般的な解析手順結果を最適化するべきであります。 どうスペクトル不混合アポトーシス核から放出される、これを達成するために必要な場合、分析プロトコル設定から標的細胞核から放出される蛍光信号を分離する必要が ビュー コントロールよく (mkate2 ラベル) 緑の蛍光チャネルにおけるカスパーゼ 3 基板なし中唯一の標的細胞を含みます。 蛍光グリーンが赤核 (核表示緑) で出力されているかどうかを観察します。 緑の蛍光性を核に感じ取ることが、イメージング ソフトウェアのスペクトル分離制御にアクセス、緑の信号が消えるまで緑から削除赤の割合を増やす (我々 の経験でこれは通常明るい mKate2 の 6-7%蛍光)。 蛍光グリーンが、核の明確でないスペクトル分離は必要ありません。注: このスペクトル分離補正テストは、カスパーゼ 3 の基板を含む培地における標的細胞の井戸を使用しても行うことが。ただし、通常蛍光よりもむしろカスパーゼ 3 拡散の活性化による緑色蛍光を発光、いくつかのターゲット細胞核の標的細胞 (10% 未満) の自発的アポトーシスの非常に低いレベルがあります。真蛍光拡散は、蛍光グリーンをすべて核で感じ取ることがこれらの条件の下で明らかです。 赤と緑のチャネルにおけるカスパーゼ 3 基板なしの中でも唯一エフェクター細胞 (核ラベルなし) を含むコントロールを個別表示します。 緑または赤の蛍光が核で出力されているかどうかを確認します。個々 のチャンネルに感じ取ることができます赤も緑の蛍光スペクトル分離は必要ありません。注: 我々 の経験、CD8 マウスで+ T セルは自動蛍光ではない、したがってスペクトル分離必要はありません、これらのセル。補正するスペクトル分離のテストは、カスパーゼ 3 の基板を含む培地で細胞の井戸を使用しても行えます。ただし、通常自発的アポトーシスのカスパーゼ 3 の活性化による緑色蛍光を発光エフェクター細胞核の結果のいくつかのレベルがあります。真蛍光拡散は、蛍光グリーンをすべて核で感じ取ることがこれらの条件の下で明らかです。 両方の蛍光チャネルに蛍光のオブジェクトを解決するのにには、サンプルは、関連するパラメーターを持つ蛍光背景差分法 (例えば、トップハット) を使用します。注意: 緑のチャネルで使用してトップハット (核半径 10.0 μ m、緑蛍光しきい値を = = 0.7 緑校正ユニット)。赤のチャネルで使用してトップハット (核半径 10.0 μ m、赤い蛍光しきい値を = = 0.5 赤校正ユニット)。 エッジを分割するための適切なパラメーターを使用すると、個々 の蛍光核を解決できます。注: 我々 は、緑色または赤色蛍光チャネルの分割エッジを使用しませんでした。 標的核の最小サイズを決定する (カスパーゼ基板) を用いた標的細胞だけを含む井戸から赤のチャンネルに画像を使用します。注意: 80 μ m2を使用します。 アポトーシス エフェクター核の平均サイズを決定する (カスパーゼ基板) とエフェクター細胞のみを含む井戸から緑のチャンネルに画像を使用します。注: 単一のアポトーシス エフェクター核がこれらの実験で 40-80 μ m2からであった。 解析手法 (例えば、最小面積、最小直径) 適切な最小サイズ制限を使用して蛍光ターゲット細胞核の数をカウントする設定 (図 2、ターゲット検出マスク)。注意: 最小の核領域 (赤い蛍光性) を使用して = 80 μ m2。 アポトーシス エフェクター核 (図 2、サイズ制限されたアポトーシス マスク) の平均サイズよりも大きいであるアポトーシス核の数をカウントする解析プロシージャを設定します。注: サイズ フィルターを 80 μ m2に設定した (このサイズより大きい緑の蛍光性のすなわち、唯一領域数えられた、従って単一のアポトーシス エフェクター核を除く)。これらのパラメーターを使用してエフェクター細胞のアポトーシスのいくつかの集計をカウントがありますが、アポトーシスターゲット細胞核を数える解析の精度が向上します。 どこ (ステップ 7.6) から赤の蛍光シグナルと (ステップ 7.7) から緑色の蛍光信号をサイズ限定大幅共存して (図 2R 核をカウントすることによりアポトーシス細胞数をカウントする解析方法を設定します。/G 重複マスク)。注: 適切な共局在は、標的核の平均のサイズの 100% に 30% から及ぶかもしれない。オーバー ラップのサイズのフィルターは、40 μ m2に設定されました。 全体の時間にわたってアポトーシス ターゲット細胞核の数だけでなく、実験条件ごとに井戸のターゲット細胞核の数を決定します。 8. データ解析計算を行い、ソフトウェアのグラフ 手順 7.9 実験井戸全体の時間経過で取得したアポトーシス ターゲット細胞核数をグラフします。実験条件ごとに複数の井戸を使用する場合は、グラフィカルに平均 ± 標準偏差として結果を提示します。 各時点でのターゲット セルの数によって各ウェルのアポトーシス細胞数を割ることによって標的細胞の人口のアポトーシスの割合を計算します。 8.2 のステップで得られた結果をグラフ化します。 各曲線の曲線 (AUC) の下の領域を決定します。必要な場合、ピークが発生した時点だけでなく、各曲線の人口のピーク アポトーシスの割合をまた定められるかもしれない。実験条件の決定 AUC が適切な統計テストを使用して大幅に異なるかどうかを決定します。注: ウェルチの補正と対になっていない t 検定は、AUC 結果に適用されました。