マウスと次世代シーケンサーによるひと抗体のレパートリーの同定

制度のガイドラインによると、国立研究所の感染疾患動物ケアおよび使用委員会の承認を得て、すべての動物実験が行われました。本報告では、代表的な結果はの国立感染症研究所、東京、日本、倫理委員会の承認を得て実行し、インフォームド コンセントを書かれてとして使用、健康な成人のボランティアから PBMCs のサンプリングが得られました。各参加者から倫理委員会承認フォームを使用します。 1. プライマー デザイン 免疫グロブリンを増幅する cDNA に普遍的な前方のプライマーを設計 mRNA の 5′-レース11,12とスマート PCR13技術において、PCR のプライマーからバイアスなし。 免疫グロブリン VH 遺伝子増幅用逆プライマー8,14 (図 1 a) として一定の領域に免疫グロブリンのクラス固有のシーケンスを設計します。注: 多重タグ シーケンスは、異なるサンプル ソースからライブラリの分子をラベルにこれらのプライマーのいずれかに追加できます。使用キット15のマニュアルに従って、nested pcr 法のシーケンスも追加できます。 普遍的な前方プライマー 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ 逆にマウス免疫グロブリン (Ref.8) のためのプライマー IgM_CH1: 5′-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3′ IgG1_CH1: 5′-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3′ IgG2c_CH1: 5′-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3′ IgG3_CH1: 5′-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3′ IgA_CH1: 5′-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3′ Igκ_CH1: 5′-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3′ Igλ_CH1: 5′-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3′ 逆にひと免疫グロブリン (Ref.14) のためのプライマー IgM_CH1: 5′-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3′ IgG_CH1: 5′-AAGACCGATGGGCCCTTG-3′ IgD_CH1: 5′-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3′ IgA_CH1: 5′-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3′ IgE1_CH1: 5′-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3′ IgE2_CH1: 5′-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3′ Igκ_CH1: 5′-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3′ Igλ_CH1: 5′-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3′ 免疫グロブリンの pcr のためのプライマー シーケンスの表 1: 2 免疫細胞や組織からの核酸分離 注: 以下の手順は、マウス脾臓から核酸を抽出するためです。ただし、他の免疫細胞やリンパ節などの人間の細胞や末梢血単核球 (PBMCs) (図 1 b) に適用されます。 組織、例えば、8 週齢の c57bl/6 マウスから脾臓の解剖し、分散した細胞を得るため PBS バッファーの 2 ml ステンレス製メッシュ (200 に 400 μ m) を通過します。2.0 mL 容マイクロ チューブ 600 × g 4 ° C で 5 分間遠心し、細胞懸濁液を転送します。上清を捨てます。 ペレットに ACK 溶解バッファー (150 mM NH4Cl、1 mM KHCO3ナ2EDTA、pH 7.2 0.1 mM) の 800 μ L を追加し、組織で赤血球を溶解する 2 分間氷の上をインキュベートします。 2 ml の PBS 3 の組織細胞を洗う x、600 × g 4 ° C で 5 分間遠心分離によって続いた。 ペレットにフェノール/グアニジン イソチオ シアン酸試薬の 800 μ L を追加渦徹底的にしで約 25 ° C で 5 分間加温します。 クロロホルム (200 μ L) を追加、手動で 15 の振る s、約 25 ° C で 2 分間インキュベートしと。 段階を区切って 12,000 × g 25 ° C で 15 分間遠心分離し、上層の水相を新鮮なチューブに転送します。 70% のエタノールの渦は簡単に 1 つのボリュームを追加し、シリカ スピン列に適用します。 水の 30-100 μ L の RNA を溶出します。 初期の RNA 濃度を蛍光光度計 (資材表) を使用して量的に表わします。 -80 ° C で浄化された RNA を保存します。 3. cDNA 合成や PCR 増幅 注: 以下の方法は、5′-レース11,12とスマート PCR 技術13に基づいています。詳細と反応の最適化は、キット15のマニュアルで説明します。マウス免疫グロブリンの原料は、2.10 の手順例です。ひと免疫グロブリンの原料は、サンプル、胎児の組織から例 PBMC、2.10 に 2.3 の手順の説明どおりに処理します。 5′-レース CD プライマー (オリゴ dT 含む) と15製造元の指示に従ってスマート PCR のオリゴヌクレオチド (資材表) を使用して総 RNA テンプレートの 10 μ g を 2 から最初繊維の cDNA を合成します。 マウス免疫グロブリンで、普遍的な前方プライマーおよび免疫グロブリン クラス固有の逆のプライマー (表 1) を使用して忠実度の高い DNA ポリメラーゼと PCR 増幅 cDNA。として熱サイクリング条件を設定: 2 分後 30 94 ° C の 40 のサイクルの 94 ° C s、59 ° C 30 s、および 30 のための 72 ° C s、5 分 72 ̊ C で最終的な拡張ステップが続きます。注: 典型的な実験は、素朴な依存 Th1 と Th2 依存性 B 細胞 (図 3) を見て IgM、IgG1、IgG2c、Igk Igl の免疫グロブリン クラスを増幅します。 ひと免疫グロブリンの 1st PCR のタグ シーケンスとユニバーサルの前方プライマーおよび免疫グロブリン クラス固有の逆のプライマー (表 1) を使用してを実行します。2nd PCR によって各サンプルのインデックスのシーケンスが含まれてインデックス シーケンスのプライマーを使用しています。次の PCR 条件および Taq のポリメラーゼを使用: 2 分、21 サイクル (1st PCR) または 32 サイクル (2nd PCR) 94 ° C で 30 94 ° C s、59 ° C 30 s、30 のための 72 ° C s。注: 典型的な実験は、IgM、IgD、(IgG1, IgG2, IgG3, igg4 抗体の IgG、IgA (IgA1 と iga2 は)、すべて B 細胞 (図 4) を見て Igl、Igk ige 抗体の免疫グロブリン クラスを増幅します。 Agarose のゲルの PCR の製品を electrophorese し、シリカ膜のスピン列を使用して 600 に 800 bp フラグメントを浄化します。 3.2.1、3.2.2 2% の agarose のゲルからのサンプルを electrophorese します。 UV transilluminator の DNA バンドを視覚化して 600 に 800 の間ブロード バンドを含んでいるゲルのスライスを bp。 ゲルのスライスの 10 mg 当たりの膜結合溶液 10 mL を追加します。ミックスし、ゲルのスライスを完全に溶解するまで 50-65 ° C で孵化させなさい。 ゲル溶液をシリカ膜のスピン-列に転送します。洗浄液で 1 回洗浄し、ヌクレアーゼ フリー水 (材料表) の 50 mL の DNA を溶出します。 NGS の配列のための等しい量で各免疫グロブリンのクラスから、プールを蛍光光度計 amplicons と精製産物を定量化します。注: 通常、2 〜 10 mg 増幅 DNA は免疫グロブリンのクラスごとに回復されました。10-20 ng/mL の DNA を含む上昇 50 mL の溶液を与える DNA 量で均等に各サンプル ソリューションをミックスします。 サイズとライブラリ ベースのマイクロ キャピラリー電気泳動を用いた DNA サイズ チップ (材料表) の濃度を決定します。20 ° C のライブラリを保存します。 4 ライブラリの NGS シーケンス シーケンス実行指定するサンプル名、インデックス情報の SampleSheet.cvs を生成し、.fastq ファイルのみを取得するように指示します。 試薬カートリッジ (材料表) とライブラリを解凍します。 0.2 N NaOH を行い目的のモル濃度を取得するライブラリを希釈します。 すすぎし、乾燥のフロー ・ セル。試薬カートリッジのウェルに希薄と変性・ ライブラリ ・ ソリューションの 600 mL を追加します。 シーケンス処理の実行を開始します。 5。 NGS データの品質管理 16「FASTX ツールキット」を用いた FASTQ データの品質管理を実行します。注: 使用するパラメーター設定の基本的な例は以下のとおりです。fastq_quality_trimmer v t 20 l 200 -i [InFilename.fastq] o [InFilename.fastq]fastq_quality_filter v q 20 p 80-i [InFilename.fastq] o [InFilename.fastq]fastx_reverse_complement v-i [InFilename.fastq] o [InFilename.fastq] 以下のコマンドで「fasta 核酸 (.fna)”に出力ファイルを書式設定。fastq_to_fasta – v の-n-i [InFilename.fastq] o [InFilename.fna] 6.fna データから免疫グロブリン シーケンスの抽出と分析。 注: サンプル プログラムは UNIX 環境で実装されました。例を参照してパフォーマンス可能性がありますオペレーティング システムとハードウェア環境に依存しているため、それらを使用してください。著者は、エラーまたは不作為について責任を負いません。プログラミング言語、Perl17、R18、および必要なモジュールは、引用のウェブサイト上の指示に従ってインストールする必要があります。IgBLAST プログラムは、適切な web サイト19,20上の指示に従ってインストールする必要があります。 Https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine からレパートリー解析の社内プログラムの次の例をダウンロードします。03_PipeLine_Mouse.zip;マウス抗体シーケンスの解析のためのサンプル プログラムのセット。05_PipeLine_Human.zip;ひと抗体シーケンスの解析のためのサンプル プログラムのセット。 シーケンス データを読み込み、抗体抽出: 各免疫グロブリンの一定した領域 (表 2) で署名シーケンスを検索する Perl プログラムによってデータ (.fna) から各免疫グロブリン クラスの免疫グロブリン (Ig) シーケンスを抽出します。 マウス免疫グロブリン重鎖 (IgH) 遺伝子の以下のコマンドで、読み取りを抽出します。$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [入力ファイル名] [出力ファイル名 (サフィックス)] マウス免疫グロブリンの軽鎖 (IgL) 遺伝子は、以下のコマンドで読み取りを抽出します。$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [入力ファイル名] [出力ファイル名 (サフィックス)] ひと免疫グロブリンの重鎖 (IgH) 遺伝子を以下のコマンドで、読み取りを抽出します。$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [入力ファイル名] [出力ファイル名 (サフィックス)] ひと免疫グロブリンの軽鎖 (IgL) 遺伝子を以下のコマンドで、読み取りを抽出します。$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [入力ファイル名] [出力ファイル名 (サフィックス)] 注釈を付け、V (D) J の遺伝子組換えの生産性をチェックします。注: 以下の方法はスタンドアロン IgBLAST19 V (D) J 遺伝子セグメント シーケンス内のアノテーションを利用しています。説明20V (D) J の遺伝子のデータベースと IgBLAST のパラメーター設定を設定します。 次のコマンドでマウス免疫グロブリン重鎖 (IgH) 遺伝子注釈を付けます。$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-生物マウス – domain_system imgt-クエリ/$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_。file/mouse_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>./$OutName 次のコマンドでマウス免疫グロブリン軽鎖 (IgL) 遺伝子注釈を付けます。$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-生物マウス – domain_system imgt-クエリ/$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_。file/mouse_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>./$OutName 以下のコマンドでひと免疫グロブリン重鎖 (IgH) 遺伝子注釈を付けます。$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-生物人間 – domain_system imgt-クエリ/$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_。file/Human_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>./$OutName 以下のコマンドでひと免疫グロブリン軽鎖 (IgL) 遺伝子注釈を付けます。$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-生物人間 – domain_system imgt-クエリ/$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_。file/human_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>./$OutName 抗体レパートリーのグローバル機能を視覚化します。 次のコマンドでマウス IgH レパートリーを視覚化します。$ .00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh注: 入力ファイルは filename.fna (順序データ)、できれば 6.2.1 から出力ファイル。このファイルは、”filename”という下位ディレクトリ (フォルダー) に配置する必要があります。シェル スクリプトの行 50 の Para_4 の「ファイル名」を割り当てます。 以下のコマンドで人間の IgH レパートリーを視覚化します。$ .00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh注: 入力ファイルは、filename.fna シーケンス データできれば 6.2.3 の出力ファイルです。このファイルは、配置する必要があります下のディレクトリ (フォルダー) の名前は「ファイル名」。シェル スクリプトの行 46 の Para_4 の「ファイル名」を割り当てます。 次のコマンドでマウス IgL レパートリーを視覚化します。$ .00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh注: このパイプラインを持つ Igk と Igl 処理されます付随しています。入力ファイルは好ましくは filename.fna (順序データ)、6.2.2 から出力ファイル。このファイルは、”filename”という下位のディレクトリ (フォルダー) に配置する必要があります。シェル スクリプトの行 53 の Para_4 の「ファイル名」を割り当てます。出力ファイル名の「_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt」で終わる (図 3、IgL) 2 次元バー グラフ座標を与えます。 以下のコマンドで人間の IgL レパートリーを視覚化します。$ .00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh注: このパイプラインを持つ Igk と Igl 処理されます付随しています。入力ファイルは、filename.fna シーケンス データできれば 6.2.4 の出力ファイルです。このファイルは、”filename”という下位ディレクトリ (フォルダー) に配置する必要があります。シェル スクリプトの行 53 の Para_4 の「ファイル名」を割り当てます。”_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt”で終わる出力ファイル名 (図 4IgL) 2 次元バー グラフの座標を与えます。