幼虫斑马鱼外系头发细胞的活体钙成像
Summary
斑马鱼是一个模型系统, 具有许多有价值的功能, 包括光学清晰度, 快速的外部发展, 并特别重要的听力和平衡领域, 外部位于感觉毛细胞。本文概述了转基因斑马鱼如何被用来检测毛细胞机械和突触前功能。
Abstract
感觉毛细胞是在内耳中发现的机械感受器, 是听力和平衡所必需的。头发细胞被激活的反应感官刺激机械偏转顶端突起称为头发束。偏转打开机械传导 (met) 通道在头发束, 导致大量的阳离子, 包括钙。这种阳离子汇集使细胞失去极化, 并打开位于发细胞前部基部的电压门控钙通道。在哺乳动物中, 毛细胞被包裹在骨骼中, 在体内评估这些活动的功能是很有挑战性的。相反, 幼虫斑马鱼是透明的, 并拥有一个外部定位的侧线器官, 其中包含毛细胞。这些毛细胞在功能和结构上类似于哺乳动物的毛细胞, 可以在体内进行功能评估。本文概述了一种技术, 利用基因编码的钙指标 (geci), gcmp6, 测量刺激诱发钙信号在斑马鱼侧系毛细胞。gcamp6 可与共聚焦成像一起用于测量侧系毛细胞的顶端和基部的体内钙信号。这些信号提供了这些毛细胞内机械和突触前依赖钙活性的实时、可量化的读数。这些钙信号还提供了有关毛细胞如何检测和传递感官刺激的重要功能信息。总的来说, 这项技术产生有用的数据有关钙活性在体内的相对变化。它不太适合对钙变化的绝对数量进行量化。这种体内技术对运动伪影很敏感。为了正确定位、固定和刺激幼虫, 需要合理的练习和技能。最终, 如果执行得当, 本文中概述的协议提供了一种强大的方法来收集有关头发细胞在活体动物体内的自然、完全整合状态中的活动的有价值的信息。
Introduction
功能性钙成像是一个强大的工具, 可用于监测许多细胞的活动同时 1。特别是, 使用基因编码钙指标 (gecis) 进行钙成像已被证明是有利的, 因为 gecis 可以在特定的细胞类型和局部细胞2中表达。在神经科学研究中, 这些特征使使用 geci 的钙成像成为一种强有力的方法, 既可以定义神经元网络中的活动模式, 也可以测量单个突触 3,4处的钙流入.利用这些特征, 最近的一项研究使用共聚焦显微镜和 gecis 来监测感觉毛细胞集合中的亚细胞活动5。
毛细胞是在水生佐中检测内耳的声音和前庭刺激以及水生佐中侧线系统中的局部水运动的机械感受器.头发细胞往往是损伤或基因突变的目标, 导致人类最常见的听力损失形式, 即所谓的感音神经性听力损失8,9。因此, 了解这些细胞是如何运作的, 以了解如何治疗和预防听力损失是至关重要的。为了正常运作, 毛细胞利用两个特殊的结构, 称为机械传感器束和突触丝带, 分别检测和传输刺激。发束位于毛细胞的顶端, 主要由被称为立体纤毛的细发状突起组成 (图 1a)。在前庭和侧腰状毛细胞中, 每个发束也有一个长的质纤毛 (细胞唯一真正的纤毛), 它可以远远延伸到立体纤毛之上 (图 1a)。机械感官刺激会使头发束偏转, 偏转会使张力放在连接立体声10 的“提示链接” 上。这种张力打开了位于立体纤毛的机械传导 (met) 通道, 导致了包括钙 11,12在内的阳离子的顶端流入。这种顶端的活动最终会使毛细胞去极化, 并在细胞的底部打开电压门控钙通道 (cav 1.3)。cav 1.3通道与突触带相邻, 突触前结构在活动区系上囊泡。通过 cav1.3 通道的基底钙流入是需要的囊泡融合, 神经传递, 和激活传入神经元13,14.
多年来, 电生理技术, 如全细胞贴片夹紧, 一直被用来探测许多物种的毛细胞的功能特性, 包括斑马鱼15,16,17, 18,19,20。这些电生理记录在听力和平衡领域特别有价值, 因为它们可以用来从单个感觉细胞中获得极其敏感的测量结果, 其目的是编码非常快速的刺激。频率和强度范围广 21,22。不幸的是, 全细胞记录不能测量毛细胞的数量。为了研究斑马鱼侧系细胞的活性, 利用微音电位和传入动作电位测量了单个神经瘤的机械敏感和突触后反应特性的总和23 ,24岁.不幸的是, 整个细胞记录和局部场电位测量都没有空间分辨率来精确定位单个细胞内发生活动的位置或测量种群内每个细胞的活动。最近, 钙染料和 geci 被用来绕过这些挑战 25,26。
在斑马鱼中, geci 已被证明是一个强有力的方法来检查毛细胞功能, 由于相对容易创建转基因斑马鱼和光学清晰度的幼虫27。在斑马鱼幼虫中, 毛细胞存在于内耳以及侧线系统中。侧线是由类似玫瑰的毛细胞簇组成的, 称为神经母细胞, 用于检测水运动的局部变化 (图 1)。侧线特别有用, 因为它位于鱼的表面的外部。这种接触使得刺激毛细胞和在完整的幼虫中光学测量钙信号成为可能。总体而言, 容易发生的转基因, 透明的幼虫, 以及无与伦比的进入侧向毛细胞, 使斑马鱼成为一个宝贵的模型, 研究在体内的毛细胞的活性。这是一个显著的优势相比, 哺乳动物的系统, 其中毛细胞被骨结构的内耳包围。由于缺乏接触, 很难在体内获得哺乳动物毛细胞的功能测量。
这里概述的协议描述了如何监测 met 通道和突触前的变化, 钙在单个毛细胞内和细胞之间的单个斑马鱼。该协议利用已建立的转基因斑马鱼系, 表达膜本地化的 gcmp6 控制下的毛细胞特异性肌球蛋白6b启动子 28.这种膜定位定位 gcmp6, 以检测钙通过离子通道在质膜, 这是至关重要的发细胞功能。例如, 膜局部 gcmp6 可以检测钙的流入通过 met 通道在顶端的发束和通过 cav1.3 通道附近的突触丝带在细胞的基础。这与使用细胞溶胶中的 geci 形成鲜明对比, 因为细胞质 geci 检测到的钙信号是 met 和 cav1.3 通道活性的组合, 以及来自其他来源的钙贡献 (例如,商店释放)。该协议概述了如何固定和麻痹 gcamp6 的转基因幼虫之前成像。然后, 它描述了如何准备和使用流体喷射器, 以偏转的头发束, 以控制和可复制的方式刺激侧系毛细胞。介绍了使用该协议可以实现的代表性数据。还提供了表示运动工件的数据示例。描述了用于验证结果和排除工件的控制实验。最后, 介绍了斐济软件中空间钙信号的可视化方法。本斐济分析是根据以前使用 matlab5开发的可视化方法进行调整的。总体而言, 该协议概述了一种强大的制备技术, 该技术利用幼虫斑马鱼中的 geci 来测量和可视化体内的毛细胞钙动态。
Protocol
根据动物研究议定书 #1362-13年, 所有动物工作都得到了国家卫生研究院动物使用委员会的批准。 注: 如果解决方案和设备提前准备和设置, 则此协议大约需要0.5 至1小时才能完成, 而不会中断。该方案针对 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29斑马鱼幼虫在受精后3-7天进行了优化。这条转基因线表达了一个膜本地化的 gcmp6 (斑马鱼的二氧化碳优化), 特别是在所有斑马鱼毛细胞。在成像之前, 幼虫在标准条件下在胚胎缓冲液 (e3) 中饲养。有关执行本协议所需的所有设备和药物的目录编号, 请参阅材料表。 1. 解决方案的准备 制备1毫升α-本藻毒素 (125μm), 用于在功能成像过程中麻痹斑马鱼幼虫。 加入968.6 微米微米的超纯无菌水和33.4μl 的苯酚红, 以1毫克的α-烟叶毒素 (整个瓶子)。制作100μl 的等价物, 并将其存放在-20°c。注意事项:处理α-烟通粉时, 请戴上手套, 并在引擎盖中做好准备。在处理α-本糖毒素溶液时, 也建议使用手套。 准备1升的60x 胚胎缓冲液 (e3)。 在954.4 毫升超纯水中加入17.2 克氯化钠和0.76 克的 kcl 粉。 在溶液中加入 1 m ccl2的 19.8 ml、1 m mgso4的 19.8 ml 和 1 m hepes 缓冲区的 6 ml。将 60x e3 库存解决方案在4°c 下存放长达6个月。 制备 1x e3 的10升 (5 mm 氯化碳; 0.17 mm kcl; 0.17 mm ccl 2; 0.17mm mgso 4, ph 7.2), 这是幼虫在功能成像之前传播的溶液。 在超纯水的10升中加入167毫升的 60x e3 库存溶液, 制成 1x e3 溶液。在室温 (rt) 下存放 1x e3 溶液长达6个月。 制备神经元缓冲液 (nb) (140 mm 氯化钠; 2 mm kcl; 2 mm ccl 2; 1 mmmgcl2; 10 mm hepes 缓冲液, ph 7.3), 用于在功能成像过程中浸没幼虫。注: 1x e3 也可用于功能成像, 但在 nb 中, 响应更可靠。 将 5 m 氯化钠的28毫升、1 m kcl 的2毫升、1 m ccl2的2毫升、1 m mgcl 2 的 1 ml 和 1 mhepes 缓冲液的10毫升与957毫升的超纯水进行组合。使用 1 m naoh 将 ph 值降低到7.3。 过滤消毒。在4°c 下存放, 最长1个月。注: 在使用解决方案之前, 请先将其带到 rt。 制备 ms-222 股票 (旋塞因, 0.4%), 用于麻醉幼虫。 在100毫升蒸馏水中溶解400毫克 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐盐和800毫克na 2 hpo4 。将 ph 值调整为7。存放在4°c。 在固定和α-本足曲霉毒素注射过程中, 使用 0.04% ms-222 麻醉幼虫。 2. 成像室和引脚的制备 准备成像室 (图 2a)。在沿方块边缘的灌注室底部涂一层薄薄的高真空硅脂, 盖板将粘附在该地方。不要在油脂中留下缝隙。在盖板边缘用力按下, 将其密封到成像室。擦掉多余的油脂。请注意:建议使用带有200μl 微移液头的5毫升注射器, 用于润滑脂。 准备有机硅封装填充室。将碱基与固化剂的10:1 比例 (按重量) 混合。充分混合, 但轻轻地, 使用微移液器尖端, 以创建最小的气泡。 将硅胶封装层倒在贴面盖板上, 使其与腔体表面持平。大约3克的密封剂将充满腔室。 小心地将腔体踩在平坦的表面上, 同时保持其水平, 或使用微移液器尖端 (在立体显微镜下) 将气泡移除或拉到腔体边缘。 在60–70°c 的温度下, 将室内放置在实验室烤箱中过夜。将室内放置在通风箱内, 以确保热空气不会直接吹过封装, 以避免产生波纹。 使用细钳和钨丝来制作用于通过硬化封装上的头部和尾部固定幼虫的针脚 (图 2b1)。 要制作头针, 请在立体显微镜下一只手拿一块 0.035 mm 的钨丝。使用另一只细钳, 在90°的温度下将导线从末端弯曲1毫米。更换钳子为精细剪刀, 并在弯曲后切割1毫米, 以创建引脚。 重复步骤2.3.1 使用 0.025 mm 的电线来制作尾针, 但在弯曲的两侧留下 0.5 mm 的电线。使用钳子将引脚插入腔内硬化的封装 (用于存储)。 3. 准备治疗麻痹和刺激的针 用带有灯丝的玻璃毛细血管准备心脏注射针。将针头拉到内尖直径为 1–3μm (图 2c)。 使用无灯丝的玻璃毛细血管准备流体喷射针。用细长的尖端拉针, 可以打破到正确的尖端直径。 将液体喷射针的细长尖端垂直摩擦在另一个喷液针头或瓷砖上, 使针尖可以弯曲, 以形成内尖直径为 30–50μm [图2c (中间图像) 和图 3a2]。确保断裂是均匀的尖端 (图 2c, 中间图像), 而不是锯齿状或过大 (图2 c, 右图), 以保证在毛细胞刺激过程中均匀和准确的流体流动。请注意:针头抛光机可用于修复锯齿状断裂。 4. 将幼虫固定到成像室 在大约1毫升的 e3 缓冲液中沐浴 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 幼虫, 其中包含 0.04% ms-222, 在成像室的硅胶封装表面上 1– 1分钟, 直到幼虫变得不动或对触摸无反应。 在立体显微镜下, 将幼虫放置在灌注室的中心, 使其平躺在侧面, 靠在硅胶封装上。请注意:为了保持一致性, 请始终将幼虫安装在同一侧 (例如, 右侧向下, 左侧向上) (图 2b1)。 使用精细的钳子, 将 0.35 mm 的头针向下垂直于幼虫和腔。将头针插入眼睛和泡泡之间, 向下插入包封剂 (图2b1 和 2B1)。在固定时, 使用第二套钳子来稳定幼虫沿其背侧或腹侧。确保销钉的水平部分与幼虫接触, 不会一直压入密封剂。将引脚侧向倾斜 (图 2b1) 或稍微指向鱼的前部, 以避免干扰随后的心脏注射和毛细胞成像。 使用钳子, 将 0.025 mm 的尾针插入到靠近尾端的脊索中 (图 2b1)。请注意:要小心, 避免伸展幼虫。将幼虫固定。眼睛应该叠加 (图 2b1)。这对于心脏注射的易用性非常重要 (图 2b2-b2 ‘, 步骤 5), 方便理想的成像平面 (图 1b1-b2 ‘ ‘,步骤8和 9), 并量化流体射流刺激的强度 (图 3a3, 步骤 7)。 5. 将α-bungarotoxin 注入心脏腔以麻痹幼虫 请注意:处理α-本黄毒素时, 请戴上手套。 离心前简单地离心α-本黄毒素, 以防止心脏注射针堵塞。 用凝胶加载移液器尖端将α-本黄毒素溶液回填心脏注射针。将溶液均匀地加载到没有气泡的尖端。 将心脏注射针插入连接到手动微机械手上的移液器支架中。在立体显微镜下, 将针头放置在垂直于固定和麻醉幼虫的 a-p 轴的位置, 指向约30°的角度。 将移液器支架连接到压力喷射器。应用以下建议设置: p呈为 100 hpa, 推拉 = 0.5秒, pc偿 = 5 hpa。在溶液中注入一个小球, 以测试针尖是否为专利。 寻找一小口红色溶液 (从苯酚红色) 离开针尖。如果没有看到红色, 非常温和地刮针尖对一个针的边缘, 再试一次, 直到针专利。或者, 拔针与较大的尖端开口。 将针头向心脏推进, 直到它接触到心脏外的皮肤 (图 2b2)。将针头压入幼虫, 寻找心脏前皮肤上色素细胞的压痕, 以确保针头位于相对于幼虫的正确平面上 (图 2b2 ‘)。 进一步推进针, 直到它刺穿皮肤, 并进入心脏腔。把针稍微拉回来。向心脏腔中注入α-本黄毒素的小球。寻找心脏腔的膨胀或红色染料进入腔。 用1毫升的 nb 轻轻冲洗幼虫 3次, 以去除残留的 ms-222。千万不要除去所有的液体。在灌注室保持幼虫在大约1毫升的 nb 中。请注意:确保在固定和心脏注射后以及在整个成像实验中, 幼虫的心跳和血液流动保持强劲。 6. 显微镜和流体射流装置的制备 使用材料表中描述的组件组装直立共聚焦显微镜: 带有488纳米激光和适当过滤器的共聚焦显微镜, 用于控制和协调成像和刺激的显微镜软件, 10倍空气目标, 60x 水目标, 压电-z 目标扫描仪 (用于 z 堆栈), 高速摄像机, 圆形室适配器, 机动级, 和阶段插入适配器。有关显微镜设置的其他选项和指导, 请参阅张等29。 组装流体射流由3个主要部件组成: 真空和压力泵、高速压力夹具和头部阶段 (也在材料表中描述)。使用高速压力夹具控制压力或真空放电的时间和持续时间, 从头部阶段进入流体射流移液器。 通过厚壁硅胶管将头台的输出连接到流体射流移液支架。 7. 幼虫和流体射流的对齐 请注意:每个神经元内有3个感兴趣的平面: (1) 发束的尖端 (图 3a3: 用于测量刺激强度的动感症);(2) 发束 met 平面 (图 1b1-b1 ‘: 检测到 met 通道相关钙信号的顶端发束的底部);和 (3) 突触平面 (图 1b2-b2 ‘: 在毛细胞底部检测突触前钙信号的地方)。这些平面在图 1a 中进行了概述。 使用凝胶加载尖端将10μl 的 nb 倒入适当断裂的流体喷射针 (从步骤3.2 开始)。将溶液均匀地加载到没有气泡的尖端。将针头插入连接到电动微机械手的移液器支架中。 将灌注室放入显微镜舞台上的圆形腔适配器中。请注意:为了保持一致性, 始终将幼虫放置在相同的方向 (例如, 包含幼虫的腔, 其后部向流体喷射, 腹侧朝向实验者)。 移动机动舞台, 使幼虫位于视野的中心。转动圆形腔适配器, 使幼虫的 a-p 轴与流体射流针的轨迹大致对齐。 利用透射光和差分干涉对比度 (dic), 使幼虫聚焦并将其集中在10倍目标下。提高10倍的目标。 使用电动微机械手, 将流体喷射针向下带入视场的中心, 使其被透射的光线照亮, 几乎不接触到 nb 解决方案。 降低10倍的目标。聚焦在幼虫上, 确认其位置。集中注意力找到液体喷射针。在 x 轴和 y 轴中移动带有微机械手的流体喷射针, 直到它处于与鱼背侧平行的位置。 把注意力集中在幼虫身上。在 z 轴处把针头放下。将针头沿鱼的背侧放置, 并将其与身体约1毫米的距离 (图 3a1)。 小心移动圆形腔适配器 (如有必要), 以确保流体喷射针沿幼虫的 a-p 中线对齐 (图 3a1)。 移动机动舞台, 将感兴趣的神经体放置在视野的中心。保持流体喷射针尖沿鱼的背侧。不要将流体喷射针的尖端接触到幼虫或腔表面。 切换到60x 水目标。确保目标沉浸在 nb 解决方案中。使用精细的焦点来定位一个使用透射光和 dic 光学的神经母细胞。请注意:这种设置是为了刺激沿主要后侧线的神经瘤。这些神经质体内的毛细胞对前向或后定向流体流动有反应。有关侧线系统内神经体液体敏感性的准确图谱, 请参见 chou 等人。 将流体喷射针与微机械手放置在一起, 使其距离神经母的外缘为 100μm (图 3a2)。请注意:选择提供清晰自上而下视图的神经母细胞 (图 1B1’-b2 ‘ 和图 3a3), 而不是侧向视图 (图 1c1-c2)。清晰的自上而下的视图允许在单个光学平面中同时对所有根尖发束进行成像, 或在较少的光学平面上对突触区域进行成像 (图 3a3)。 集中注意顶端发束 (运动学) 的尖端 (图1 a,图 3a2和3A2)。流体喷射针的底部应该是这个平面的焦点。 将高速压力夹具从手动模式设置为外部模式, 以接收来自成像软件的输入。 按下 “零” 按钮, 将高速压力夹降至零。使用设定定点旋钮设置静止压力稍正 (~ 2 毫米汞柱)。使用连接在头部级输出上的 psi 压力计确认高速压力夹具的静止输出。请注意:在静止时设置一个稍微正的压力, 以避免液体随着时间的推移逐渐吸收到流体喷射针。如果流体进入连接到流体喷射器的管道并到达头部阶段, 则会损坏设备。 确定刺激发束所需的压力。使用0.125 和 0.25 v 输入 (6.25 和 12.5 mmhg) 200-500 毫秒应用测试刺激 (图3 a3-a3 ‘ ‘)。请注意:高速压力钳将电压输入 (从连接到高速压力夹命令端口上的 bnc 端口的软件或其他设备) 转换为从头部阶段排出的压力, 最终将流体喷射针 (1.0 v = 50) 转换为压力, 而-1.0 v =-50 毫米汞柱)。在这种配置 (见步骤 7.2) 正压 (推送) 偏转发束向前面, 和负压 (拉) 偏转发束向后部。 使用透射光和 dic 光学以及刻度条, 测量直径的距离6.25 和 12.5 mmhg 刺激的尖端, 运动束 (图 1a和图 3a3-3 ‘ ‘ ‘)。选择将束 (作为1个内聚单元) 移动约5μm 的压力 (图 3a3 ‘ ‘)。确保运动症的尖端一直处于焦点状态。 沿幼虫的 a-p 轴移动流体射流±25μm, 以找到使动力学位5微米尖端偏转的距离和压力。请注意:在幼虫 3-7 dpf 中使用 gcmp6, 5μm 的偏转应达到接近饱和的 gmmp6 钙信号, 并且不应损坏顶端发束结构 (图 3a3 ‘ ‘)。较小的位移距离可用于提供非饱和刺激 (图 3a3 ‘)。位移距离和 gt;10 微米很难估计 (图 3a3 ‘ ‘ ‘), 并且可能会随着时间的推移而产生损害。信号饱和度取决于神经母细胞的年龄 (和神经间高度) 以及所使用的指示器。在成像过程中, 定期检查流体喷射针在每个方向上的通畅度 (压力/推和真空拉)。流喷针容易堵塞, 失去真空通畅, 但它们保持残余压力通畅。使用 dic 光学和一个短的测试刺激在每个方向, 以检查流体射流通畅度。 将样品聚焦到感兴趣的平面上 (例如, 顶部发束的基部或突触平面中的毛细胞基部;图 1b1-b2 ‘)。 8. 成像采集程序选项 1: 单面采集 请注意:此协议中概述的所有成像都在 rt 中执行。 设置成像软件, 以获取流式或连续80帧采集, 每100毫秒捕获一次, 以实现 10 hz 的帧速率。 设置增益、光圈和激光功率以优化信号检测, 但避免饱和度、光漂白和噪声。opterra\ sfc 的示例设置如下: 488 nm 激光功率:50 (发束 met 平面)、75 (突触平面);35微米缝隙;增益 = 2.7;em 增益 = 3900。请注意:如果信号太弱或太嘈杂或光漂白过多, 则应用 2 x 分箱。2 x 分档将以牺牲空间分辨率为代价增强信号检测。 选择一个刺激, 在30帧后3秒的80帧 (8秒) 采集过程中提供。请注意:一些例子刺激如下: 200 ms (+ 或-0.25 v) 至 2秒 (+ 或-0.25 v) 在前或后向步, 以确定每个毛细胞的方向敏感性;2秒, 5 hz 方波 (0.25 v 为200毫秒,-0.25 v 代表200毫秒, 重复 5次) 同时刺激所有毛细胞。正压 (前刺激) 会激活一半的毛细胞。负压 (后部刺激) 会激活下半侧毛细胞。确保刺激软件或设备在刺激完成后将压力夹恢复到 0 v。 测量机械敏感钙的反应。聚焦在顶端发束的底部 (图 1 a 和1b1-b1 ‘), 并开始图像采集。请注意:如果从上到下清晰地观察神经母细胞 (图 1b1-b1 ‘), 所有的顶端发束都可以在一个平面上同时成像。 测量突触前钙的反应。聚焦在毛细胞的底部 (图 1 a 和1b2-b2 ‘), 并开始图像采集。请注意:如果从上到下清晰地观察神经母细胞 (图 1b2-b2 ‘), 则所有毛细胞的突触前成像平面都可以在2-3 个距离为2μm 的平面中获得。Tg[myo6b:ribeye-樱桃]转基因鱼可用于识别和定位突触前丝带和钙进入位点29。 9. 成像采集程序选项 2: 多平面采集 调整附加在60x 目标上的压电 z, 以实现快速收购 (12–18毫秒)。确保选择了最大速度设置。 使用 piezo-Z 创建 z 堆栈采集。在步长为0.5μm 的5个平面上获取发束 met 活性, 在步长为1μm 的5个平面上采集突触前信号。 将帧速率设置为 10 hz。每20毫秒将捕获每帧20毫秒, 每100毫秒捕获每个 z 堆栈。 以 10 hz 的速度流采集设置400帧或 80 z 堆栈的采集。 设置激光功率、孔径和增益以优化信号检测, 但避免饱和度、光漂白和噪声。opterra\ sfc 系统的示例设置如下: 488 nm 激光功率:75 (发束 met 平面)、125 (突触平面);35微米缝隙;增益 = 2.7;em 增益 = 3900。请注意:如果信号太弱、太嘈杂或光漂白过多, 则应用 2 x 分箱。2 x 分档将以牺牲空间分辨率为代价增强信号检测。 选择一个刺激, 在收购期间提供, 从帧150开始, 3秒后。 继续上述单平面采集协议, 但将 z 堆栈集中在顶端或基平面 (步骤8.4 和 8.5) 中。 10. 控制: 所有发钙信号的药理阻滞 注: 在首次建立该协议时, bapta (1, 2-双 (对氨基氧) 乙醇-n、n、n ‘、n ‘-四乙酸) 处理是一个关键的控制。 完成步骤8或9后, 将 nb 替换为含有 5 mm bapta 的1毫升 nb, 以切割位于发束中的顶端 met 通道所需的尖端链接。 在 rt 孵化10-20分钟。 用1毫升的 nb 清洗 bapta 3次。 重复步骤8或9。在 bapta 处理后, 无论是在顶端的发束还是突触平面上, gcmp6 的荧光都不应该有任何变化。如果 gcmp6 荧光的变化持续存在, 这些不是真正的钙信号, 可能是运动伪影。 11. 控制: 突触前钙信号的药理块 (可选) 完成步骤8或9后, 用含有10μm 异丙胺的 nb 将 nb 替换为0.1% 的二甲基亚硫酸 (dmso), 以阻断毛细胞前置的 l 型钙通道。 在 rt 孵化10分钟。 在不进行清洗的情况下, 重复步骤8或9。治疗后, 在顶端的发束中, 仍然应该有 gcmp6 的荧光变化, 以响应流喷刺激, 而不是突触平面。如果 gcmp6 荧光的变化持续在突触平面上, 这些都不是真正的钙信号, 可能是运动伪影。 12. 图像处理和数据的图形表示 请注意:使用斐济 (步骤 12.1– 12.1.5) 和图形程序 (步骤 12.2– 12.2.3) 执行步骤12。堆栈、涡轮 (步骤 12.1.3)、时间序列分析器 v3 (步骤 12.1.4 12.1.6) 和斐济插件也是必需的 (请参见材料表)。 在斐济打开图像序列, 可以是单平面时间序列 (80 帧单平面), 也可以是 z 帧时间序列 (400 帧多平面)。点击 “文件”, 从下拉菜单中选择 “导入”, 然后点击 “图像序列”。 对于 z 堆栈时间序列, z 投影每个时间点 (每个时间点5个平面) 以创建80帧图像序列。点击 “图像”, 从下拉菜单中选择 “堆栈”, 从下拉菜单中选择 “工具”, 然后点击 “分组 z 项目”。选择 “平均强度” 作为投影方法, 然后为 “组大小” 输入 “5”。请注意:z 堆栈中的每个平面都可以单独分析以获取其他空间信息。 从图像采集的 8秒 (80 帧) 中删除前 1秒 (10 帧)。点击 “图像”, 从下拉菜单中选择 “堆栈”, 从下拉菜单中选择 “工具”, 然后点击 “制作子堆栈”。为 “切片” 输入 “11-80″。请注意:此子堆栈将被称为stk1。 使用 stackreg 插件32注册图像序列 (stk1)。点击 “插件”, 选择 “stackreg”, 然后选择 “翻译” 作为70帧时间序列的注册方法。请注意:此注册的子堆栈将被称为stk2。 使用 times 系列分析仪 v3 插件提取 gcmp6 强度 (f) 测量。在stk2的顶端发束或突触前地点放置感兴趣的区域 (roi)。有关如何使用时间序列分析器 v3 的说明, 请参阅 imagej 网站 (有关链接的材料表)。请注意:对顶端发束使用 1-2μm roi 循环, 对突触平面使用 3-5μm roi 循环 (图 4a1和4A1)。 选择测量参数。点击 “分析”, 选择 “设置测量”, 并确保只选择 “平均值”。 在 roi 管理器中, 选择所有 roi, 并使用多措施函数为时间序列中的每个 roi 生成 (f) 强度值。在 roi 管理器中, 单击 “更多 & gt; & gt;”, 然后从下拉菜单中选择 “多测量”。 绘图 (f) 值。将 “多测量” 结果中的值 (f) 粘贴到图形程序中, 以创建 x-y 图形 (图 4a1 ‘ 和 4A1 ‘)。请注意:手动创建 (x) 值或使用元数据中的时间戳。 通过从刺激前框架1–20中平均图形程序中的 (f)值, 量化每个 roi 的基线 (f)。 对于每个 roi, 从每个时间点的 (f) 值中减去 (f), 以创建 f (f-f o)值。如果需要, 请重新绘制。 计算和绘制 ffo.对于每个 roi, 按 (f) 和重绘(图 4a1 ‘ 和 4A1 ‘ ‘)划分 f 测量值。 13. 时空钙信号的图像处理和热图表示 请注意:以前创建斑马鱼侧系毛细胞中钙信号的空间热图表示的工作使用了 matlab 5,28中编写的自定义软件。这一分析已适用于开放源码分析软件斐济33。使用斐济执行下面概述的所有步骤。堆栈和 turboreg 斐济插件也是必需的 (见材料表)。 对每个 z 堆栈或单个平面时间序列执行步骤 12.1-12.1.3, 以创建称为stk2 的注册子堆栈。 使用stk2创建基线图像。点击 “图像”, 从下拉菜单中选择 “堆栈”, 然后选择 “z 项目”。为 “投影类型” 选择 “平均强度”, 为 “开始切片” 输入 “1”, 为 “停止切片” 输入 “20”。请注意:这个 z 投影将被称为基线 img。 将70帧 (f) 图像序列 (stk2) 暂时装入 14 0.5 s 的垃圾箱。点击 “图像”, 从下拉菜单中选择 “堆栈”, 从下拉菜单中选择 “工具”, 然后点击 “分组 z 项目”。选择 “平均强度” 作为 “投影方法”, 然后为 “组大小” 输入5。注: 此分组 z 投影将在图 5中称为stk2bin和 f。 从绑定 (f) 图像序列 (stk2bin) 中减去基线的像素值 (basineimg), 以创建 f 图像序列。点击 “处理”, 然后从下拉菜单中选择 “图像计算器”。选择stk2bin作为 “image1″,选择基本 img作为”Image1”.为 “操作” 选择 “减去”。请注意:在图 5中, 这种基线减法 z 投影称为stk2binbl和 f-bl = f。 选择所选的查找表 (lut) 以显示 f 图像序列 (stk2binbl)。点击 “图像”, 从下拉菜单中选择 “查找表”, 然后点击所选的 lut。请注意:”红热” 是图 5中使用的 lut。图5中的这种带 lut 的基线减法 z 投影称为stk2binbl-lut和 f lut。 设置stk2binbl-lut 的最小 (最小) 和最大 (最大) 亮度值。点击 “图像”, 选择 “调整”, 然后点击 “亮度/对比度”。设置最小值以从stk2binbl-lut 中删除背景噪声。设置最大值以保留感兴趣的信号, 但避免信号饱和 [例如, 200 到 1600 (12位图像强度范围 = 0 到 4095)]。请注意:在进行可视化比较或表示时, 请使用相同的最小值和最大值。在斐济, 每个 lut 图像序列 (例如, stk2binbl-lut) 都可以生成一个 f 校准 lut 条。点击 “分析”, 选择 “工具”, 然后点击 “校准栏”。取消单击 “叠加”, 生成单独的图像, 并使用 lut 校准栏作为参考。 将 ruf (stk2binbl-lut)与所需的 lutand 临时绑定 (f) 图像 (stk2bin) 序列转换为 rgb。点击 “图像”, 选择 “类型”, 然后点击 “rgb 颜色”。请注意:rgb 转换后的 z 预测将分别称为stk2binbl-lut-rgb和stk2bin-rgb。 将 f lut 图像 (stk2binbl-lut-rgb) 覆盖到绑定 (f) 图像 (stk2bin-rgb) 上。点击 “处理”, 然后点击 “图像计算器”。选择stk2bin-rgb作为 image1,选择 stk2binbl-lut-rgb作为 Image1。为 “操作” 选择 “透明度为零”。请注意:如果 f lut 覆盖中的噪声或背景太多, 请重复步骤13.3 以增加最小值。如果存在饱和度, 请重复步骤13.3 并增加最大值。 14. 利用斐济宏观进行图像处理和时空热图表示 请注意:下一节引用了基于步骤13的名为 lut体比何来的斐济宏, 该宏将自动创建 gcmp6 信号的空间热图表示形式。这一分析需要开源分析软件斐济33和 stackreg 和 turboreg 斐济插件 (见材料表)。 下载此协议附带的斐济 lut 覆盖宏 (lutoverlaye. ijm) (请参阅补充编码文件)。 打开多平面时间序列或单平面时间序列 (请参阅步骤 12.1)。 点击 “插件”, 选择 “宏”, 点击 “运行”, 然后选择 lut覆盖宏。将出现一个对话框, 其中包含 “告诉我有关图像采集的信息”。请注意:对于对话框, 存在的数字是建议的值, 可以根据实验者使用的设置进行更改。框中和下面列出的值设置为多平面时间序列, 每个时间点有400张图像和5个平面 (步骤 9)。 在 “每个时间点的平面数” 之后, 输入每个时间点的平面数 (例如, 对于使用多平面400时间序列并每个时间点5个平面的步骤 12.1.1, 请输入 “5”)。对于单个平面采集 (例如, 步骤 8), 请输入 “1”。注: 在其余对话框中, 对于多平面时间序列, “时间点” 是指投影 z 堆栈中的数字图像 (例如, 对于步骤12.1.1 这是80个时间点)。 使用 “定义要分析的范围” 选项可删除图像序列的前 1秒 (例如, 对于步骤12.1.2 选择 “11-80” 以删除前10帧和前 1秒)。 在 “定义基线中的时间点” 之后, 输入用于创建基线图像的图像数 [例如, 对于步骤 13.2, 输入 “20” 以使用刺激前图像 (11-30)]。 在 “每个时间纸盒的时间点” 之后, 输入要用于覆盖的纸盒的图像数。(例如, 对于步骤13.2.2 选择 “5” 以创建 14个 0.5 s 箱)。 在 “最小强度” 和 “最大强度” 之后输入最小和最大亮度值, 该值将消除背景噪声 (最小值) 并保留感兴趣的信号, 同时避免饱和度 (最大值)。 在 “选择查找表” 之后, 选择覆盖所需的 lut。点击 “确定”。注: 宏将按照步骤13中提供的说明完成图像分析。宏生成的图像也将根据步骤13中的说明命名。 在处理新的图像序列之前, 请关闭所有分析窗口。
Representative Results
在 myo6b: gcmp6s-caax 转基因鱼被正确固定化, 流体射流刺激被传递到侧线毛细胞后, 可以可视化和测量强的钙信号 (图 4和图 5, 在 2 x 分页时拍摄)。在流体喷射刺激过程中, 钙信号可以测量在顶端的发束, 其中 met 通道打开响应刺激, 或在发体细胞的基础上, 其中突触前钙通道 v1.3 钙通道触发神经传递.图 4a1-a2 ” ‘ 显示了这些区域的钙反应的一个代表性例子。在这个例子中, 2-s 5 hz 流体射流刺激被传递来激活代表性神经母细胞中的所有毛细胞。在刺激过程中, 可以在头发束中检测到强的钙信号 (图 4a1-a1 ‘ ‘,显示了8个发束的反应)。在这个系统中, 几乎所有成熟的毛细胞都显示出这种钙5的顶端流入。相反, 在同一神经瘤中, 基部有可检测到的钙信号, 只有一个子组 (~ 30%) 的突触平面上有可检测到的钙信号 (图 4a2-a2 ‘ ‘, 显示4个具有突触前反应的细胞)5。尽管有强大的顶端钙信号 (图 4a1-a1 ‘ ‘), 但4个绿色 roi 显示细胞没有明显的突触前钙信号 (图 4a2-a2 ”)。在这个有代表性的例子中 (图 4a1-a2 ‘ ‘ ‘), 彩色 rois 将顶端 met 平面 (图 4a1) 中的发束与基部突触平面中的细胞体 (图 4a2)相匹配。本示例重点介绍了如何在单个毛细胞内和毛细胞群中测量 met 依赖性和突触前钙信号。 在发束和收吸前的钙信号可以图形地绘制为原始 (f) gcmp6 强度或 f/f o gcmp6 强度 (见步骤 12, 图 4a1-a1 ‘ 和 4A1’-a2 ‘)。(f) gmp6 的图表突出显示, 每个细胞的基线荧光强度可能不同 (图4a1 和 4A1 ‘)。在 fo gcmp6 图中, 每个单元被归化为其基线值, 并绘制了基线的相对强度变化 (图 4a1 ‘ 和 4A1 ‘ ‘)。在 (f) 和 f/o gcmp6 图中, 顶端发束和基部突触前平面中的钙信号随着刺激的开始 (灰色框) 而启动, 并在刺激结束后呈指数级下降. 在刺激过程中, 如果偏转强度不改变, 发束中的钙信号会迅速上升并饱和 (图 4a1-a1 ‘ ‘)。相反, 在突触平面上可检测到钙信号的毛细胞子集中, 钙信号逐渐增加, 不太容易饱和 (图 4a2-a2 ‘ ‘ ‘)。在没有突触前钙信号 (绿色 roi) 的毛细胞中, 钙信号保持在接近基线的水平。 除了这些图形表示 (图 4), 钙信号可以在整个神经场内的空间可视化在记录的过程中。图 5显示了一个时空表示的例子, 用于神经母细胞基平面上的突触前 gcmp6 信号。在图 5中, 为空间可视化处理图像序列的主要步骤概述了步骤13中所述。首先, 原始 (f) gcamp6 图像是临时绑定的 [图 5: 第1行 (14个垃圾桶中的 5个); 步骤 13.2.1]。然后, 从 (f) gcmp6 的荧光信号中减去从刺激前帧 (步骤 13.2) 计算的基线图像, 以获得 f 图像 (图 5: 第2行; 步骤 13.2.2)。接下来, f 灰度图像将转换为颜色 lut (图 5: 第3行, 红色热 lut; 步骤 13.3)。最后, 将具有 lut 转换的 f 图像叠加到时间绑定 (f) 图像上 (图 5, 第一行), 以揭示刺激期间神经母细胞内的时空信号 (图 5: 第4行; 步骤 13.4)。f gcmp6 信号的热图提供了宝贵的空间和时间信息, 不容易从单个 roi 和图 4中使用的图形中解析出来。热图可以帮助可视化关键的时空信息, 包括每个毛细胞内钙信号的发生和持续时间的亚细胞信息, 以及整个毛细胞之间的时间和强度差异神经母细胞。 重要的是要验证图形和空间热图是否代表真实的钙信号, 而不是由于运动而产生的人工制品。在这个协议中, 运动伪影可能是由于流体喷射刺激而导致幼虫过度漂移或运动或运动的结果。所有这些工件都具有挑战性, 在体内制剂中完全消除。虽然图像序列的注册 (步骤 12.1.3) 可以纠正 x 轴和 y 轴的大多数移动, 但必须识别 z 轴中运动过大的图像序列, 并将其从分析中删除。运动伪影是最容易通过绘制钙信号来识别的。在毛细胞的顶点 (图 4b1 ‘-b1 ‘ ‘ ‘ ‘) 和基部 (图 4 c1 ‘-c1 ‘)可以观察到 gcmp6 强度变化的例子, 这些变化是伪影, 而不是真正的gcamp6信号。 在顶端的发束中, 当流体射流刺激太强时, 运动伪影是常见的 (图 3a3 ‘ ‘ ‘)。在这些过强的刺激过程中, 顶端的发束平面可以在流体射流刺激过程中移出焦点, 然后在刺激结束后返回到原来的焦点平面 (图 4b1’-b ‘)。这使得它很难准确地测量顶端 met 依赖钙信号。在图 4b1 ‘-b1 ‘ ‘ ‘ 中可以看到发束运动伪影的一个例子。在这里, 图表显示 gcmp6 信号减少期间的刺激 (灰色框) 时, 头发束是不集中。刺激结束后, 随着发束恢复到原来的位置并重新进入焦点, gcmp6 的信号迅速增加。这与图 4a1-a1 “中的例子形成鲜明对比, 在该示例中, 根钙信号在刺激开始时增加, 在刺激结束时减少。 虽然由于过多的流体射流刺激而产生的运动也会使突触平面脱离焦点, 但这种类型的运动伪影在这种平面上并不常见。相反, 由于幼虫的运动或漂移而导致 z 轴焦距的变化是运动伪影最常见的原因。幼虫运动或漂移会影响 gcamp6 在毛细胞的先端和基部的测量。图 4c ‘-c ‘ ‘ 显示了在刺激过程中增加基部、突触平面 gcmp6的幼虫运动的一个例子。运动伪影 (图 4c1-c1 ‘ ‘)可以通过检查 gcamp6 信号的时间过程与真正的突触前信号区分开来 (图 4a2-a2 ‘ ‘)。gcmp6 信号的运动诱导的增加不是随着刺激而呈指数级增长和下降 (图 4a2-a2 ‘ ‘), 而是具有正方形, 并随着刺激的开始和偏移而突然上升和下降 (图 4c1 ‘-c1 ‘)。 除了仔细检查 gcmp6 信号的时间过程外, 还可以利用药理学进行控制实验, 将真正的 gcamp6 信号与运动伪影区分开来。例如, bapta (步骤 10) 可用于在发束中切割 met 通道功能所需的提示链接。bapta 应通过 ca v1.3 通道消除流化射流-诱发电位 met-t钻孔性钙的流入以及随后的基底、突触前钙的流入.在流体喷射刺激过程中真正的刺激诱发钙信号 (图 4a1-a2 ‘ ‘ ‘)的典型例子中, bapta 治疗后, 顶端和基面 gcmp6 荧光的所有变化都将被消除。相反, gcamp6 荧光的变化由于运动, 如图 4b1 ‘-b1 ‘ “和4c1 ‘-c1 ‘ ‘ ‘ 不会消除 bapta 处理。 除了使用 synaptic 来消除所有刺激引起的 gcmp6 信号外, 还可以应用 (步骤 11) 来特别阻止 ca v 1.3 依赖于突触平面的钙流入, 同时离开顶端的 mett 通道依赖钙流入原封不动 5.在没有运动伪影的单个神经体中应用异丙滨后, 在流体喷射刺激过程中, 在根毛束 (图 4a1-a1 ‘ ‘ ‘) 中gcmp6 荧光的变化将保持不变, 而所有突触 gcm6 s 都将发生改变。将消除基座上的荧光变化 (图 4a2-a2 ‘ ‘)。在异丙二醇应用后, 突触平面上 gcamp6 信号的任何变化 (例如, 图 4c1-c1’) 很可能与运动伪影相对应。 图 1: 侧线神经元和功能成像平面概述。(a)左边的图表描绘了一个神经体的侧面视图, 有四个毛细胞体 (黑色) 接触突触后传入神经元 (蓝色)。丝带 (绿色) 系绳泡在每个细胞内的突触前活动点。每个细胞体的顶端是一捆立体纤毛 (1 微米), 包含 met 通道。每个发束都有一个运动细胞, 将水运动的机械力传递到发束的底部。右侧的关系图在自上而下的视图中描述了相同的模型。在此自上而下的视图中, 黑色用于表示左侧图中描述的四个单元格, 而灰色用于表示神经母细胞中的其他单元格。在这个模型和这两个视图中, 突出了三个重要的平面: (1) 用于量化发束偏转大小的发束 (运动学) 的尖端, (2) 在毛束底部的顶端 met 平面, 其中钙进入细胞在刺激过程中, 和 (3) 突触平面在细胞的基部, 钙进入接近突触丝带。(b1-b1 ‘)dic 和 gcmp6 自上而下的图像的 met 平面在发束的基础上, 在那里机械相关的钙信号可以记录。(b2-b2 ‘)dic 和 gcmmp6 的自上而下的图像来自与 b1-b1 ‘ 相同的神经体, 但在突触平面的神经母细胞的底部, 在那里可以检测到突触前的钙信号。(c1-c2)表示 gcmp6 的神经体的图像, 其中幼虫安装不当。在本例中, 单元格底部的顶端 met 平面 (c1) 和突触平面 (c2) 被定位在一个次优角度。这个位置不允许所有的发束在一个平面上成像, 需要更多的成像平面来捕捉这个神经体内所有突触的活动, 而不是 b1-b2 ‘。图像为 5 dpf 的幼虫。c2 中的刻度条对应于 b1-c2 中的所有图像。请点击这里查看此图的较大版本. 图 2: 成像室、斑马鱼安装和心脏注射程序, 以及针头。(a)显示是一个成像室, 其幼虫 (由虚线矩形概述) 固定在硅胶封装的中心。(b1)显示的是一个 5 dpf 幼虫固定由两个引脚。一个大的头针被放置在垂直的身体只是后面的眼睛。这两只眼睛完全叠加在一起, 所以下眼完全被上眼遮挡。一个小的尾巴销与尾巴中的脊索相交。幼虫是平的, 没有扭曲。(b2)为了麻痹幼虫, 心脏注射针垂直于身体, 并带来了与心脏相邻。心脏注射针应接触心脏前的色素细胞。(b2 ‘)针的抑郁进入皮肤会导致心脏前面色素细胞的压痕。(c)针按顺序从左到右: 心脏注射针的例子, 开口约为3微米;一个好流体喷射针的例子以大约50微米的开头;一个坏坏的流体喷射针, 是大的和锯齿状的, 很可能会产生过度和不规则的刺激的例子。请点击这里查看此图的较大版本. 图 3: 流体射流对准、定位和刺激校准。(a1)显示是一种幼虫定向与头部面向左, 尾巴向右, 和流体喷射针定向平行的甲鱼体的 a-p 轴。这种流体射流针对齐, 以刺激神经母细胞, 响应前 (推压) 和后 (拉普/真空) 定向流体流动。(a2)显示的是一个神经体 (由虚线概述) 和顶端束的提示 (运动性) 在左侧的面板和流体喷射针的右侧的面板。流体射流的位置约为100微米, 从神经母细胞的边缘。(a3-a3 ‘ ‘ ‘)根尖束 (运动性) 的尖端是偏转不同的距离, 由不同的流体射流刺激压力。单个运动枕尖端的轨迹为 1.5μm (a3 ‘) 和 5μm (a3 ‘ ‘) 偏转距离。黑色圆圈表示动感的休息位置。重要的是, 运动性不能偏出太远, 否则刺激强度无法可靠地量化, 并可能变得具有破坏性 (a3 ‘ ‘ ‘)。请点击这里查看此图的较大版本. 图 4: 在侧系毛细胞的流体射流刺激过程中, 顶端 met 和基部突触前 gcmp6 信号。(a1-a2 ‘ ‘)gcmp6 的强度在具有代表性的神经系统内的流体射流刺激过程中发生了变化。左边的图像显示了同一神经元内的顶端 met 平面 (a1) 和基部突触平面 (a2)。用 a1 和 a2 编码的 roi 颜色绘制了每个图像右侧的 (f) 和 fmf gcmp6 强度图的时间过程。(b1-b1 ‘ ‘)流体喷射刺激过程中运动过的顶端 met 图像序列的例子。左侧的图像 (b1) 显示了用于向右绘制 (f) 和 f·fcmp6 强度图的 roi。(c1-c1 ‘ ‘)在基部突触平面上显示运动伪影和 gcmp6 信号变化的图像序列的示例, 这些变化不是真正的钙信号。左侧 (c1) 上的图像显示了用于将 (f) 和 f/f gcmp6 强度图绘制到右侧的 roi。每个图形中的灰色框表示流体射流刺激在每个图像序列中的持续时间。a1-a2 ‘ ‘ ‘ 和 b1-b1 ‘ ‘ 的例子中使用了 2-s 5 hz 流体射流刺激。在 c1-c1 ‘ ‘ 中, 使用了2的前步刺激。(f) gcmp6 图的 y 轴描述了从斐济图像强度测量中获得的任意单位 (a. u.)。所有的例子都来自 4-5 dpf 的幼虫。所有图像的刻度条 = 5μm。请点击这里查看此图的较大版本. 图 5: 流体喷射刺激过程中突触前 gcmp6 信号的时空可视化.概述了在刺激过程中在神经系统内可视化 gcmp6 强度时空变化的步骤。时间根据图像顶部的时间戳从左到右表示。顶行显示了70帧 gcmp6 (f) 图像序列 (步骤 13.2.1) 中的14个时间箱中的5个。在第二行中, 基线 (步骤 13.2) 已从每个 (f) GCaMP6s 绑定图像中删除, 以创建 f 图像 (步骤 13.2.2)。在第三行中, f 图像已从灰度 (第二行) 转换为红色热 lut (步骤 13.3)。这些 lut 图像的最小值和最大值是根据右侧 (步骤 13.3.1) 的相对 f 强度 (a. u.) 的红色热 lut 热图设置的。在底部行中, 第三行已覆盖到顶行中的 (f) 图像 (步骤 13.4)。图顶部的灰色条表示 2-s 5 hz 流体射流刺激的时间。这个例子来自一个 5 dpf 幼虫。右侧显示了相对 f 强度 (a. u.) 的红色热 lut 热图的图例。所有图像的刻度条 = 5μm。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在完整的动物体内成像本质上是具有挑战性的。这种方法的几个步骤对于从侧系毛细胞中获得可靠的体内钙测量至关重要。例如, 在成像之前正确地固定和麻痹幼虫, 以最大限度地减少成像过程中的运动, 这一点非常重要。成像过程中的过度运动会导致 gcmp6 荧光的变化, 这些变化不是真实的信号, 也不符合钙水平的变化 (例如,图 4b1 ‘-b1 ‘ 和 4c1 ‘-c1 ‘)。尾针可以放置更多的前部, 以帮助尽量减少运动, 虽然这可能会导致更多的后神经瘤无法进入。此外, 心脏注射后, 头针可以旋转, 使针的水平部分位于整个蛋黄。除了改变别针的位置外, 还可以用脑片竖琴代替别针固定幼虫 34。当正确地放置在幼虫上时, 竖琴是一种额外的、可能不太侵入性的固定幼虫方法。虽然明显的运动可能是由于固定不足, 未能正确地进行心脏注射, 以提供α-本藻毒素和麻痹幼虫可以导致不完全瘫痪, 运动, 并最终运动伪影。虽然常用的麻醉剂已被证明会影响斑马鱼毛细胞的兴奋性, 但最近的研究表明, 麻醉苯并不能干扰毛细胞活性的许多方面。同样, 更常用的麻醉 ms-222 只干扰毛细胞活性的某些方面15。因此, 由于α-本加洛辛注射液的挑战性, 苯并卡因或 ms-222 的应用可能被证明是一种有用的替代方法麻痹, 以防止在功能性钙成像过程中在幼虫中的运动。
除了该协议所涉及的技术挑战外, 如果在每次成像实验之前和期间幼虫和毛细胞都不健康, 即使是完全安装的样品也是无用的。为了确保幼虫和毛细胞的健康, 重要的是幼虫应保存在 e3 缓冲液中, 而 e3 缓冲液中没有碎屑, 如绒毛膜 (蛋壳)、废物和微生物。虽然侧系毛细胞的表面位置有利于成像, 但当 e3 缓冲液被污染时, 这种位置使它们更容易受到细胞损伤。一个干净的, 水的环境是特别重要的年轻幼虫 (2-4 dpf) 或突变体, 不能保持直立游泳的位置, 主要位于皮特里菜的底部。在这些情况下, 侧系毛细胞和护皮束周围的保护杯很容易被破坏。即使从健康的幼虫和毛细胞开始, 在每个实验的整个过程中, 确保幼虫有心跳和快速的血液流动也是至关重要的。如果血液流动减慢或停止, 毛细胞的健康可能会受到损害。在涉及不健康幼虫或失血过多的受损制剂中, 可以通过几种方式确定垂死的毛细胞: 第一, 通过核死瘤或核冷凝的出现, 表现为 dic 光学下细胞内的气泡;第二, 细胞收缩和细胞质内存在快速移动的颗粒;第三, 当动感小贴在不同的方向上突出时.当头发束被破坏时, 在刺激过程中, 被打结的阴群不会在一起协调运动。
这种准备有几个小的局限性, 一个是准备工作在建立后的1-3小时内保持稳健。使用较小的针脚或脑片竖琴固定幼虫和添加灌注系统等修改可能会延长这种在体内制剂的寿命。另一个限制是, 在重复成像试验后, 可能会发生光漂白和光毒性。克服这一挑战的一个令人兴奋的方法是调整光片显微镜的这一协议。光片显微镜是减少聚焦光的一种强大方法, 可减少光漂白和光毒性36。在一起, 温和的固定化和较少的照片曝光可能有助于延长每个成像周期。更长时间的成像课程可用于检查伴随发育而来的功能变化的整个持续时间, 以及损伤后头发细胞清除和再生的过程。重要的是要指出, 除了光片显微镜, 该协议可以适应其他类型的共聚焦系统 (点扫描, 2 光子和旋转磁盘), 以及相对简单的宽场系统28,34.总体而言, 它的多功能性使这一协议成为一个有价值的工具, 可以适应和使用多个成像系统。
虽然该协议可以适应和使用的许多成像系统, 该协议的部分也可以调整和使用 (1) 除 gcmp6 以外的其他指标和 (2) 图像活动的其他感觉神经和神经元在幼虫斑马鱼。例如, 在前面的一项研究中, 我们使用该协议在侧向毛细胞内使用多个基因编码指标来检测细胞质钙 (rgecon1)、囊泡融合 (SypHy)、膜电压 (bongwoori) 和膜的图像活动钙 (jRCaMP1a-caax 和 gcmp6s-caax), 并在侧向传入过程中检测膜钙 (gcmp6s-caax)5。根据我们使用这些指标的经验, 本协议中描述的转基因线 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 为侧线神经母细胞的成像活动提供了一个很好的开端。在上面列出的所有指标中, 我们发现 gcmp6 是最敏感和最光稳的。除了这些功能, 我们突出了 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 转基因线, 因为它可以用来进行两个不同的测量: 头发细胞机械和突触前钙在一个单一的转基因线。
本文概述的技术演示了斑马鱼侧线中的钙成像如何成为研究毛细胞在其本地环境中如何发挥作用的有力方法。这种方法是对哺乳动物研究的补充, 在哺乳动物体内外植体中目前正在研究毛细胞功能。此外, 斑马鱼模型可以继续作为一个平台, 以测试基因编码指标的有效性, 然后可以用于检查在哺乳动物毛细胞的活性。
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 nih/nidcd 校内研究基金 1ZIADC000085-01 (k. s. k.) 的支持。我们要感谢 c迪 wong 在编写斐济宏方面提供的协助。我们还要感谢吴多丽丝和黄坎迪对协议提出的有益建议。
Materials
| Section 1 | |||
| α-Bungarotoxin | R&D Systems | 2133 | For paralyzing larvae prior to imaging |
| Phenol red Solution 0.5% | Sigma-Aldrich | P0290 | For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing larvae |
| Section 2 | |||
| Imaging chamber | Siskiyou | PC-R | Platform to mount larvae for imaging |
| No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm | VWR | 48366-227 | To seal imaging chamber |
| High vacuum silicone grease | Fischer Scientific | 14-635-5D | For affixing of coverslip to imaging chamber |
| Silicone encapsulant clear 0.5 g kit | Ellsworth Adhesives | Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | To fill imaging chamber to create a surface to pin fish |
| Oven | Techne | HB-1D | For drying silicone encapsulant |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating wire, forceps and scissors to make pins |
| Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For making pins |
| Fine scissors | Cole-Palmer | 5.5", EW-10818-00 | For cutting tunsgten wire to make pins |
| Tungsten wire, 0.035 mm | Goodfellow | W005131 | For head pins to immobilize larvae |
| Tungsten wire, 0.025 mm | ThermoFischer Scientific | AA10405-H4 | For tail pins to immobilize larvae |
| Section 3 | |||
| Micropipette guller | Sutter Instrument Company | P-97 | For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles |
| Borosilicate glass capillaries w/ filament | Sutter Instrument Company | BF 150-86-10 | Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection |
| Borosilicate glass capillaries w/o filament | Sutter Instrument Company | B 150-86-10 | Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells |
| Pipette polisher | Narishige | MF-830 microforge | To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks |
| Ceramic tile | Sutter Instrument Company | NC9569052 | For scoring and evening breaking fluid-jet needles |
| Sections 4 & 5 | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For pinning larvae |
| Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling heart injection needles |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating larvae during pinning and heart injection |
| Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection |
| Pressure injector | Eppendorf | Femtojet 4x | To deliver α-bungarotoxin |
| Sections 6, 7 & 8 | |||
| Confocal microscope | Bruker | Swept field/Opterra confocal microscope | Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters |
| Microscope software | Bruker | Prairieview 5.3 | To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet |
| 10X air objective | Nikon | MRH00101 | Low magnification for positioning of larvae and fluid jet |
| 60X water objective | Nikon | MRF07620 | Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm) |
| Piezo-Z objective scanner with controller/driver | Physik Intruments instruments/Bruker | 01144210/UM-Z-PZ | High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy |
| EMCCD camera | QImaging | Rolera EM-C2 EMCCD camera | Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s |
| Circular chamber adapter | Siskiyou | PC-A | For holding and rotating imaging chamber on microscope stage |
| Motorized Z-deck stage | Prior Scientific | ZDN12MP | Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together |
| Z-deck stage insert adaptor | NIH Machine shop | custom | To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage |
| Fluid-jet apparatus | ALA scientific instruments | HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP | For controlling and delivering the fluid-jet stimulus |
| Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) | Cole-Palmer | Masterflex L/S 13, 96400-13 | For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Company | MP-225 | For holding and positioning of needle holder for fluid jet |
| Micromanipulator controller | Sutter Instrument Company | MPC-200 | For controlling fluid-jet needle manipulator |
| Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling fluid-jet needles |
| Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
| PSI manometer | Sper Scientific | 840081 | For measuring pressure clamp output |
| Section 9 | |||
| BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant | ThermoFischer Scientific | B1204 | To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals |
| Isradipine | Sigma-Aldrich | I6658 | To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Solvent for pharmacological compounds |
| Section 10 | |||
| Prism7 | Graphpad | Prism7 | Software to plot GCaMP6 intensity changes |
| FIJI | Schindelin, et., al.34 | https://fiji.sc/ | Software to process images and create spatio-temporal signal maps |
| Turboreg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
| StackReg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
| Times Series Analyzer V3 Plugin | Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html | Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes |
Referencias
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
- Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
- Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
- Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
- Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
- Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
- Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
- Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
- Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
- Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
- Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
- Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
- Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).
- Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).
- Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 – Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
- Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
- Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 – Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
- Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
- Chou, S. -. W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- . Fiji is just ImageJ Available from: https://fiji.sc/ (2018)
- Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
- Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
- Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).
Citar este artículo
Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).