Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması
Summary
Yapısal olarak ilişkili proteinler sık sık farklı Biyolojik işlevleri uygulamak. Eşdeğer chimeric proteinleri oluşturmak için bu proteinler bölgelerinde alışverişi için onların fonksiyonel sapma sorumludur kritik protein bölgeleri tanımlamak için yenilikçi bir yaklaşım oluşturmaktadır.
Abstract
Bu iletişim kuralının amacı chimeric proteinler içinde ayrı bir protein bölgelerinde yapısal olarak benzer bir protein karşılık gelen onların serilerinde bu bölgeleri işlevsel önemini belirlemek için değiştirilir tasarımını kapsar. Böyle chimeras örtüşen DNA parçalarının kullanan bir iç içe geçmiş PCR protokolü aracılığıyla oluşturulur ve yeterince astar, onların ifade yerli ikincil yapı ve translasyonel modifikasyonlar sağlamak için bir memeli sistemi içinde ardından tasarlanmış.
Farklı bölge işlevsel rolü sonra Chimera uygun okuma tahlil aktivite kaybı simgesiyle gösterilir. Sonuç olarak, hangi daha fazla moleküler çözünürlüğünü artırmak için tamamlayıcı teknikleri tarafından (Örneğin site yönettiği mutagenesis) taranması bölgeleri barındıran kritik amino asitler kümesi tanımlanır. Farklı fonksiyonları ile yapısal olarak ilgili bir protein bulunabilir durumlarda sınırlı olmasına rağmen chimeric proteinler başarıyla proteinler sitokinler ve sitokin reseptörleri gibi bölgelerde kritik bağlama tanımlamak için istihdam edilmiştir. Bu yöntem özellikle protein’ın fonksiyonel bölgeleri iyi tanımlanmış olmayan durumlarda uygundur ve faiz bölgeleri dar ve tarama çaba dahil azaltmak için yönlendirilmiş evrim yaklaşımlar içinde değerli bir ilk adım teşkil etmektedir.
Introduction
Proteinler, sitokinler ve büyüme faktörleri, dahil olmak üzere çeşitli türleri üyeleri benzer üç boyutlu yapılar paylaşmak ama farklı biyolojik fonksiyonlar1,2kez sarfetmek ailelerde gruplandırılır. Bu işlevsel çeşitlilik genellikle amino asit kompozisyonu molekül’ın etkin sitelere3içinde küçük farklılıklar sonucudur. Tür siteler ve fonksiyonel belirleyicileri tanımlaması sadece sağlamıyorsa değerli evrimsel bakış açısı aynı zamanda daha açık agonistleri ve inhibitörleri4tasarlamak için. Ancak, sık sık ilgili Yapısal proteinler arasında bulunan kalıntı kompozisyon farklılıkları çok sayıda bu görevi zorlaştırmaktadır. İçeren büyük kütüphaneler inşa mutantlar yüzlerce günümüzde her tek kalıntı varyasyon değerlendirilmesi mümkün olsa bile ve bunların birleşimleri hala zor ve zaman alıcı çaba5kalır.
Büyük protein bölgeleri işlevsel önemini değerlendirme teknikleri böylece değerli için yönetilebilir numarası6mümkün artıkları sayısını azaltmak için. Kesilmiş proteinler bu sorunu çözmek için en çok kullanılan yaklaşım olmuştur. Buna göre bölgeler altında eğitim protein işlevi belirli bölge7,8,9silme tarafından etkileniyorsa işlevsel olarak ilgili olarak kabul edilir. Ancak, bir büyük bu yöntem silme protein’ın ikincil yapı, misfolding, toplama ve yetersizlik hedeflenen bölge eğitim için giden etkileyebilir kısıtlamasıdır. Sitokin oncostatin M (OSM) bir iç silme 7 artıkları daha fazla olamazdı bir misfolded mutant sonuçlandı daha büyük10okudu, kesilmiş bir sürümü iyi bir örnektir.
Chimeric proteinlerin üretimi daha büyük protein bölgeleri analizine izin veren bir alternatif ve yenilikçi yaklaşım oluşturmaktadır. Bu yöntem, belirli Biyolojik işlevleri yerine bölümlerine katkısını değerlendirmek için başka bir protein, yapısal olarak Ilgili sıralarının tarafından bir protein ilgi bölgelerinde değişimi için hedeftir. Reseptörleri işlevsel etki alanları11,12tanımlamak için sinyal alanında yaygın olarak kullanılan, chimeric proteinler protein aileler küçük amino asit kimlik ama korunmuş ikincil yapısı ile çalışmak özellikle yararlıdır. Uygun örnekler interlökin-6 ve silier nörotrofik faktör (% 6 sıra kimlik)13 ya da lösemi inhibitör faktörü (LIF) ve OSM (% 20 kimlik)6, hangi gibi interlökin-6 (IL-6) türü sitokinler, sınıfta bulunabilir protokol sonrası dayanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chimeric proteinlerin üretimi sitokin reseptör bağlayıcı etki alanları13modüler gibi adres sorular için kesilmiş proteinler sınırları ötesine gitmek mümkün olan bir çok yönlü teknik kabul ettiğiniz anlamına gelir. Chimeras tasarım çalışmaları bu tür önemli bir adımdır ve dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Daha küçük değişiklik, değişken uzunlukta tek bir bölgeye ayrıntılı çalışmalar için daha uygun olmakla birlikte işlevsel etki alanları kurmak i?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Max Planck toplum ve Schüchtermann klinik (Bad Rothenfelde, Almanya) tarafından desteklenmiştir. Bu araştırmanın bir parçası ilk biyolojik Kimya Dergisi yayımlandı. Adrian Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, s., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB döngü ve D-helix bağlama site III insan Oncostatin M (OSM) OSM reseptörü harekete geçirmek için gereklidir. J. Biol. kimyasalları 2018; 18:7017-7029. © yazarlar.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
Referencias
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Bioquímica. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI’s LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
