Определение функциональных белков регионов путем строительства химерных белка
Summary
Структурно похожие белки часто оказывают различные биологические функции. Обмена эквивалентной регионов этих белков с целью создания химерных белки представляет собой новаторский подход для выявления критических белков регионов, которые отвечают за их функциональных различий.
Abstract
Цель настоящего протокола включает в себя дизайн химерных белков, в которых отдельных регионах белка заменяются их соответствующих последовательностей в структурно аналогичных белка, с целью определения функциональной значимости этих регионов. Такие химер генерируются с помощью вложенных протокол постановки ПЦР с использованием перекрывающихся фрагментов ДНК и адекватно разработан грунтовки, а затем их выражение в рамках млекопитающих системы для обеспечения родной вторичной структуры и столб-поступательные изменения.
Функциональная роль различных региона обозначается затем потеря активности Химера в assay соответствующей индикации. В следствие определены регионы, укрывательство набор важнейших аминокислот, который может далее экранируется дополнительных методов (например , сайт Направленный мутагенез) для увеличения молекулярного разрешения. Хотя ограничиваться случаями, в которых можно найти структурно связанные белком с различными функциями, химерных белки с успехом используются для выявления критических привязки регионов в белках, таких как цитокинов и цитокина рецепторов. Этот метод особенно подходит в тех случаях, в которых белка функциональных регионов не будут четко определены и представляет собой ценный первый шаг в направленной эволюции подходов к сузить области интереса и уменьшить затраты скрининга.
Introduction
Несколько видов белков, в том числе цитокинов и факторы роста, группируются в семьях, члены которых разделяют подобные трехмерной структуры, но часто оказывают различные биологические функции1,2. Это функциональное разнообразие обычно является следствием небольшие различия в аминокислотный состав внутри молекулы активных сайтов3. Выявление таких участков и функциональных детерминанты не только предлагают ценную эволюционной но также для разработки более конкретных агонисты и ингибиторы4. Однако большое количество различий в составе остатков, часто встречаются между структурно похожие белки усложняет эту задачу. Даже несмотря на то, что строительство большой библиотеки, содержащие сотни мутантов в настоящее время это возможно, оценки каждый один остаток вариации и комбинации из них по-прежнему остается сложным и отнимает много времени усилий5.
Методы оценки функциональной значимости регионов больших белка, таким образом, значение для уменьшения числа возможных остатков к управляемым число6. Усеченные белки были наиболее часто используемых подход к решению этой проблемы. Соответственно регионы считаются функционально актуальны, если функцию белка под исследования зависит от удаления конкретного региона7,8,9. Однако главным недостатком этого метода является, что удаления может повлиять на вторичную структуру белка, приводит к сворачиванию, агрегации и невозможность для изучения предполагаемого региона. Хорошим примером является усеченная версия цитокина oncostatin M (OSM), в котором внутреннего исключения, больше, чем 7 остатков привело к смятых мутантов, которые не могут быть в дальнейшем учился10.
Поколение химерных белков является альтернативной и новаторский подход, который позволяет анализ крупных областей белка. Цель данного метода является обмен регионы интереса в протеине, структурно связанных последовательностей в другой белок, чтобы оценить вклад замененных разделов для конкретных биологических функций. Широко используется в области сигнализации приемные устройства для определения функциональных областях11,12, химерных белки являются особенно полезными для изучения белков семей с мало аминокислоты личность, но сохраняется вторичной структуры. Соответствующие примеры можно найти в классе, интерлейкина-6 (IL-6) типа цитокинов, таких как интерлейкина-6 и цилиарной нейротрофических факторов (6% последовательности идентификаторов)13 или лейкемия ингибирующего фактор (LIF) и OSM (20% удостоверение)6, на котором основан после протокола.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поколение химерных белков представляет универсальный метод, который может выйти за пределы усеченным белков на вопросы как модульность cytokine рецептор связывания доменов13. Дизайн химерами является ключевым шагом в такого рода исследований и требует тщательного рассмотре?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Общество Макса Планка и Schüchtermann-клиника (Бад-Ротенфельде, Германия). Часть этого исследования была опубликована в журнал биологической химии. Адриан Сегарра, ж. м., Шиндлер, н., Gajawada, P., Lörchner, ч., Браун, т. & Pöling, Дж. Цикл AB и D-спирали в привязки сайта III М человеческого Oncostatin (OSM) для активации рецептора OSM. J. Chem. биол. 2018; 18:7017-7029. © Авторы.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
Referencias
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Bioquímica. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI’s LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
