Festlegung der funktionellen Protein Regionen durch chimäres Protein Aufbau
Summary
Strukturell verwandte Proteine üben häufig unterschiedliche biologische Funktionen. Der Austausch von äquivalenten Regionen dieser Proteine um Chimären Proteinen zu schaffen stellt einen innovativen Ansatz zur kritischen Protein Regionen zu identifizieren, die für ihre funktionale Divergenz verantwortlich sind.
Abstract
Das Ziel dieses Protokolls umfasst das Design von Chimären Proteinen in die unterschiedliche Regionen eines Proteins durch ihre entsprechenden Sequenzen in einem strukturell ähnlichen Protein ersetzt werden, um die funktionelle Bedeutung dieser Regionen zu ermitteln. Diese Chimären entstehen mittels einer verschachtelten PCR-Protokoll mit überlappenden DNA-Fragmente und angemessen entworfen, Grundierungen, gefolgt von ihren Ausdruck in einem Säugetier-System nativen Sekundärstruktur und post-translationalen Modifikationen zu gewährleisten.
Die funktionale Rolle der eigenständige Region wird dann durch einen Verlust der Aktivität der Schimäre in einer entsprechenden Anzeige-Assay. In der Folge werden Regionen beherbergen eine Reihe von wichtigen Aminosäuren identifiziert, die weiter durch ergänzende Techniken (z.B. Site-verwiesene Mutagenese) zur Erhöhung der molekularen Auflösung gezeigt werden. Obwohl auf Fälle begrenzt, in denen strukturell verwandte Proteine mit unterschiedlichen Funktionen gefunden werden kann, haben Chimäre Proteinen erfolgreich eingesetzt worden, um kritische verbindliche Regionen in Proteine wie Zytokine und Zytokin-Rezeptoren zu identifizieren. Diese Methode eignet sich besonders in Fällen, in denen das Protein funktionale Regionen nicht gut definiert sind, und ist einen wertvollen erste Schritt gerichtete Evolution Ansätze zur Eingrenzung der Regionen von Interesse und reduzieren den Aufwand für Screening.
Introduction
Verschiedene Arten von Proteinen, einschließlich Zytokine und Wachstumsfaktoren, werden in Familien zusammengefasst, deren Mitglieder teilen ähnliche dreidimensionale Strukturen aber oft üben unterschiedliche biologische Funktionen1,2. Diese Funktionsvielfalt ist in der Regel die Folge der kleine Unterschiede in der Aminosäure-Zusammensetzung innerhalb des Moleküls aktive Zentren3. Identifikation von solchen Websites und funktionelle Determinanten bieten nicht nur evolutionäre Erkenntnisse sondern auch spezifischere Agonisten und Inhibitoren4zu entwerfen. Allerdings erschwert die große Zahl der Unterschiede in der Zusammensetzung der Rückstände häufig zwischen strukturell verwandten Proteinen gefunden diese Aufgabe. Obwohl große Bibliotheken mit Bau Hunderte von Mutanten ist heute machbar, Beurteilung jedes einzelnen Rückstände Variation und Kombinationen davon bleibt noch ein schwieriger und zeitaufwendiger Aufwand5.
Techniken, die Beurteilung der funktionalen Bedeutungdes des großen Protein Regionen sind somit von Wert, die Anzahl der möglichen Rückstände auf eine überschaubare Zahl6zu reduzieren. Abgeschnittene Proteine wurden die am häufigsten verwendete Ansatz, dieses Problem anzugehen. Dementsprechend gelten Regionen werden funktionell relevant, wenn die Funktion des Proteins unter Studie durch das Löschen einer bestimmten Region7,8,9betroffen ist. Eine große Einschränkung dieser Methode ist jedoch, dass Löschungen Sekundärstruktur des Proteins, führende Fehlfaltung, Aggregation und die Unfähigkeit die vorgesehene Region studieren auswirken können. Ein gutes Beispiel ist eine verkürzte Version von Zytokin Oncostatin M (OSM), in denen eine interne Löschung größer als 7 Rückstände fehlgefaltete Mutant geführt, die nicht weiter sein könnte10untersucht.
Die Generation von Chimären Proteinen bildet einen alternativen und innovativeren Ansatz, der die Analyse der größeren Protein Regionen ermöglicht. Das Ziel dieser Methode ist es, die Regionen von Interesse in einem Protein von strukturell verwandten Sequenzen in ein anderes Protein, zu tauschen, um den Beitrag der ersetzten Abschnitte bestimmten biologischen Funktionen zu bewerten. Weit verbreitet im Bereich der Signalisierung Rezeptoren zu identifizieren, Funktionsbereiche11,12, sind Chimäre Proteinen besonders nützlich, Proteinfamilien mit wenig Aminosäure Identität aber konservierte Sekundärstruktur zu studieren. Entsprechende Beispiele finden Sie in der Klasse von Interleukin-6 (IL-6) Typ Zytokine, wie Interleukin-6 und ciliary Neurotrophic Faktor (6 % Sequenz Identität)13 oder Leukämie hemmenden Faktor (LIF) und OSM (20 % Identität)6, auf denen die nach Protokoll basiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Generation von Chimären Proteinen stellt eine vielseitige Technik, die über die Grenzen der abgeschnittenen Proteine zu Fragen wie die Modularität der Zytokin-Rezeptor bindende Domänen13gehen kann. Das Design der Chimären ist ein wichtiger Schritt in dieser Art von Studien und erfordert eine sorgfältige Prüfung. Vorstudien, Funktionsbereiche zu etablieren erfordert in der Regel Substitution von weite Regionen in einer ersten Phase, während kleinere Erneuerungen von variabler Länge fü…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und der Schüchtermann-Klinik (Bad Rothenfelde, Deutschland) unterstützt. Teil dieser Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Die AB Schleife und D-Helix in Bindungsstelle III des menschlichen Oncostatin M (OSM) sind für die OSM-Rezeptor-Aktivierung erforderlich. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © der Autoren.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
Referencias
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Bioquímica. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI’s LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
