Identifikation af funktionelle Protein regioner gennem kimære Protein konstruktion
Summary
Strukturelt relaterede proteiner udøve ofte forskellige biologiske funktioner. Udveksling af tilsvarende regioner af disse proteiner for at skabe kimære proteiner udgør en innovativ tilgang til at identificere kritiske protein regioner, der er ansvarlige for deres funktionelle divergens.
Abstract
Målet med denne protokol omfatter udformningen af kimære proteiner, forskellige regioner af en protein erstattes af deres tilsvarende sekvenser i et strukturelt lignende protein, for at bestemme den funktionelle betydning af disse regioner. Disse kimærer er genereret ved hjælp af et indlejret PCR-protokol ved hjælp af overlappende DNA fragmenter og tilstrækkeligt designet primere, efterfulgt af deres udtryk inden for et pattedyr system til at sikre indfødte sekundær struktur og posttranslationelle modifikationer.
Den funktionelle rolle i et særskilt område angives derefter med et tab af aktiviteten af chimera i en passende udlæsning assay. Derfor identificeres regioner huser en række kritiske aminosyrer, der kan være yderligere screenet af supplerende teknikker (f.eks. site-directed mutagenese) at øge molekylære opløsning. Selv om begrænset til tilfælde, hvor der kan findes en strukturelt relaterede proteiner med forskellige funktioner, er kimære proteiner blevet med held ansat til at identificere kritiske bindende regioner i proteiner som cytokiner og cytokin receptorer. Denne metode er særligt egnet i tilfælde, hvor det protein funktionelle regioner ikke er veldefineret, og udgør et værdifuldt første skridt i styret evolution tilgange til at indsnævre regioner af interesse og reducere screening kræfter involveret.
Introduction
Flere typer af proteiner, herunder cytokiner og vækstfaktorer, er grupperet i familier hvis medlemmer deler lignende tredimensionale strukturer, men ofte lægge forskellige biologiske funktioner1,2. Denne funktionelle mangfoldighed er normalt følge af små forskelle i aminosyresammensætning inden for det molekyle aktive steder3. Identifikation af sådanne websteder og funktionaldeterminanter ikke kun tilbyder værdifuld evolutionære indsigt men også til at designe mere specifikke agonister og hæmmere4. Men det store antal forskelle i rest sammensætning ofte findes mellem strukturelt relaterede proteiner komplicerer denne opgave. Selvom konstruere store biblioteker, der indeholder hundredvis af mutanter er i dag muligt, vurdere hver enkelt rest variation og kombinationer af dem er stadig en udfordrende og tidskrævende indsats5.
Teknikker vurdere store protein regioner funktionelle betydning er således af værdi at reducere antallet af mulige rester til et overskueligt antal6. Afkortet proteiner har været den mest anvendte metode til at tackle dette problem. Regioner er derfor anses for at være funktionelt relevante, hvis funktionen protein under undersøgelse er påvirket af fjernelsen af en bestemt region7,8,9. En stor begrænsning af denne metode er dog at sletninger kan påvirke det protein sekundær struktur, fører til misfoldning, sammenlægning og manglende evne til at studere den tilsigtede region. Et godt eksempel er en trunkeret version af cytokin oncostatin M (OSM), hvor en indre sletning større end 7 rester resulterede i en fejlfoldede mutant, der ikke kunne yderligere undersøgt10.
Generation af kimære proteiner udgør en alternativ og innovative tilgang, der tillader analyse af større protein regioner. Målet med denne metode er at udveksle regioner af interesse i et protein af strukturelt beslægtede sekvenser i et andet protein, for at vurdere bidrag af de udskiftede dele til specifikke biologiske funktioner. Udbredt inden for signalering receptorer til at identificere funktionelle domæner11,12, er kimære proteiner særligt nyttige til at undersøge protein familier med lidt aminosyre identitet men bevarede sekundær struktur. Relevante eksempler kan findes i klassen af interleukin-6 (IL-6) type cytokiner, såsom interleukin-6 og ciliaere neurotrope faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukæmi hæmmende faktor (LIF) og OSM (20% identitet)6, hvor den følgende protokol er baseret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generation af kimære proteiner udgør en alsidig teknik, som er i stand til at gå ud over grænserne for afkortede proteiner til løsning af spørgsmål såsom modularitet af cytokin-receptor binding domæner13. Design af kimærer er et vigtigt skridt i denne form for undersøgelser, og kræver nøje overvejelse. Foreløbige undersøgelser at etablere funktionelle domæner vil generelt kræve substitution af brede regioner i en første fase, mens mindre udskiftninger af variabel længde er mere …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society og Schüchtermann-klinikken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del af denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB loop og D-helix i bindingssted III af menneskelige Oncostatin M (OSM) er påkrævet for OSM receptor aktivering. J. Biol. Chem. 2018; 18:7017-7029. © forfatterne.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
Referencias
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Bioquímica. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI’s LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
