ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה
Summary
אזור שוליים B תאים (MZBs) להגיב בכוח גזירה זרימה על ידי מחדש המכוונת את נתיב הנדידה שלהם כן. פרוטוקול זה מראה כיצד לתעד ולנתח את ההעברה באמצעות יחידת פלואידיקה, משאבה, מערכת הדמיה במיקרוסקופ, תוכנה חופשית.
Abstract
אזור שוליים B תאים (MZBs) הם אוכלוסיה של תאי B השוכנים באזורי העכבר הטחול שולית אופפים זקיקים. כדי להגיע הזקיקים, MZBs עליך להעביר את הכוח הטיה של זרימת הדם. אנו מציגים כאן שיטה לניתוח תזרים-induced MZB העברה זו במבחנה. ראשית, MZBs מבודדים מן הטחול העכבר. שנית, MZBs התיישבו על ליגנדים אינטגרין בשקופיות קאמרית זרימה, חשוף להטיית זרימה, עם תמונה תחת מיקרוסקופ בעת העברת. שלישית, תמונות של MZBs העברת מעובדים שימוש בתא MTrack2 אוטומטי מעקב תוסף עבור ImageJ, הרצועות תא וכתוצאה מכך הם לכמת באמצעות הכלי כימוטקסיס Ibidi. העברת הנתונים לחשוף כמה מהר להעביר התאים, באיזו תדירות הם משנים כיוון, אם הווקטור זרימה ‘ הטיה ‘ משפיעה על כיוון ההגירה שלהם, ליגנדים אינטגרין אשר מעורבים. אמנם אנו משתמשים MZBs, שיטת בקלות ניתן להתאים לניתוח העברה של כל ליקוציט המגיבה לכוח של זרימה הטיה.
Introduction
תאים חיסוניים תאי תאי ביותר בגוף האדם, לעיתים קרובות חייב להתמודד עם כוח ההטיה של זרימת הדם והלימפה. עם זאת, ישנם מחקרים מעטים יחסית על הגירה הנוצרות על-ידי כוח ההטיה של לויקוציטים1,2,3,4,5. אנו מציגים כאן פרוטוקול אמין ולא כמותיים כדי לנתח את התגובה של תא החיסון לזרימה במבחנה. ביצוע וזמינותו אינו דורש ייצור של רכיבים, כל הציוד והחומרים המתכלים הם זמינים מסחרית. הפרוטוקול, כולל ניתוח טיהור והעברה של התא, יכול להתבצע ביום אחד. בסופו של דבר, למרות שאנחנו מתארים את ההעברה של אזור שוליים B תאים (MZBs), הפרוטוקול ניתן להתאים לנתח את ההעברה נגד זרימה של סוגים אחרים של תאים חיסוניים. לכן, זה ריאלי לשימוש הזה assay לנתח באופן שיטתי מגוון רחב של לויקוציטים עם פאנל מקיף של תנאים.
MZBs הם אוכלוסייה של תאי B המצויים, העכבר, רק הטחול ואת הסעות בין הפנים של זקיקים8,97,6,אזורי שוליים. אזור שולית היא שכבה של תאים חיסוניים כ 5-10 תאים עבים. השכבה תא עוטפת הזקיק, מורכב בעיקר MZBs, המקרופאגים אבל גם הטבעית הקבועה הרוצח בתאי T (iNKT), תאים דנדריטים (Dc), נויטרופילים, בין היתר10. התאים באזור שוליים חשופים זרימת הדם חד כיווני שמקורם עורקים הטחול לסיים בסינוס שוליים סביב הזקיק. הדם זורם חורים הסינוס שולי דרך אזור שולית היא שליקט סינוסים ורידים בכשלקוח אדום ואז לשחזר את מחזור11. זרימה חופשית של דם שוטף MZBs, וחושפת אותם בפני אנטיגנים נישא בדם. MZBs נושא אנטיגן לתוך הזקיק על ידי הליכה הלוך ושוב באופן אוטומטי בין אזור שולי בתוך הזקיק, אשר אינה נחשפת דם. לפיכך, כמו הסעות MZBs כלפי הזקיק, הם עליך להעביר הכוח הטיה של זרימת דם12 (איור 1 א’).
פרוטוקול זה, אנו נתאר כיצד באופן כמותי לקבוע איך החיסון תאים כגון MZBs להגיב אין זרימה או זרימה גבוהה במבחנה, כדי לגלות איך הם מתוכנתים להעביר בתוך vivo. בשלב הראשון, MZBs כבר טהור מן הטחול העכבר באמצעות beads מגנטי מצמידים נוגדנים של ערכות זמינים מסחרית. MZBs טרי מבודד הציג לתוך הבאר של שקופית קאמרית זרימה, מותר להתיישב על ליגנדים אינטגרין, חשוף לזרימה של מאגר העברה באמצעות מערכת משאבת (איור 2 א). התאים הם צילמו באמצעות מערכת מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות. התמונות מעובדות ואז לניתוח עם תוסף ImageJ חינם, MTrack213,14, לעקוב באופן אוטומטי את התאים. רצועות ואז שניתן לכמתו חינם Ibidi כימוטקסיס כלי15 כדי לקבוע פרמטרים שונים כולל מהירות, יושר אינדקס ההעברה. ערכים אלה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של מעכבי ההעברה, תכשירים תא, נוגדנים וכימיקלים אחרים שמשפיעים על ההעברה על ההעברה הטיה זרימה המושרה על מנת להבין את כוחות שליטה תא החיסון תנועה ויוו.
Protocol
Representative Results
Discussion
נתאר כאן שיטה לניתוח ההעברה של תאי הכוח של הטיה זרימה ויוכל להגיב על-ידי שינוי ההגירה שלהם. ניתוח של MZBs הראה כי MZBs להעביר באופן ספונטני על ICAM-1, בנוכחות זרימה, להעביר את הזרם. בעבודה הקודמת, הראינו כי MZBs אינן מעבירות את הזרם על VCAM-1 אבל במקום זה יישאר קבוע במקום. מאתר הטחול אזור שוליים מכיל בעיק…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של 854/TP11 SFB “פתוח” ק-DF.
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
Referencias
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
- Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
- Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
- ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
- . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
- . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
- . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)
