JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingeniería

NanoPrecipitation Flash voor de inkapseling van hydrofobe en hydrofiele stoffen in polymere nanodeeltjes

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58757
, , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering,Princeton University

Summary

Flash NanoPrecipitation (FNP) is een schaalbare benadering voor de productie van polymere core-shell nanodeeltjes. Lab-schaal formuleringen voor de inkapseling van hydrofobe of hydrofiele therapeutics worden beschreven.

Abstract

De formulering van een therapeutische stof in nanodeeltjes (NPs) kunt geven unieke eigenschappen. Voor slecht in water oplosbare drugs, NP formuleringen verbetert de biologische beschikbaarheid en wijzigen van de distributie van drugs in het lichaam. Voor hydrofiele drugs zoals peptiden of eiwitten bieden inkapseling binnen NPs ook bescherming tegen goedkeuring van de natuurlijke mechanismen. Er zijn een paar technieken voor de productie van polymere NPs die schaalbaar zijn. Flash NanoPrecipitation (FNP) is een proces dat gebruikmaakt van gemanipuleerde mengen geometrieën om te produceren van NPs met smalle omvang distributies en afstembare maten tussen 30 en 400 nm. Dit protocol biedt instructies op de laboratoriumschaal productie van core-shell polymere nanodeeltjes van een doelgrootte met behulp van de FNP. Het protocol kan worden getroffen ter kapselen hydrofiele of hydrofobe verbindingen met slechts geringe wijzigingen. De techniek kan gemakkelijk worden ingezet in het laboratorium te scherm formuleringen duurzaame milligram. Lead hits kunnen rechtstreeks worden opgeschaald naar gram en kilogram-schaal. Als een continu proces impliceert schaalvergroting meer mengen verwerkingstijd uitvoeren in plaats van vertaling naar nieuwe procestanks. NPs geproduceerd door FNP zijn zeer geladen met therapeutische, voorzien van een dichte stabiliserende polymeer borstel, en hebben een grootte reproduceerbaarheid van ± 6%.

Introduction

Sinds de late jaren 1990, is er een gestage toename van het aantal klinische proeven nanomaterialen1,2in dienst. De groeiende belangstelling weerspiegelt de belofte van nanomaterialen te verbeteren de biodisponibiliteit van hydrofobe drugs en om preferentiële richten binnen het lichaam3. Polymere nanodeeltjes (hierna aangeduid als nanodeeltjes of NPs hier) vormen een groeiend deel van deze klasse van materialen2. NPs hebt opgeslaen belang omdat zij zeer afstembare eigenschappen zoals grootte, samenstelling en oppervlakte functionalization4hebben. Wanneer toegepast op de administratie van slecht oplosbare drugs, hebben NPs vaak een kern-shell structuur waar de therapeutische is ingekapseld in de hydrofobe kern en de shell bestaat uit een hydrofiel polymeer borstel. Een eenvoudige manier voor het genereren van deze structuur heeft een amfifiele diblock copolymeren (BCP) bestaande uit een afbreekbaar hydrofobe blok, dat deel van de kern van de deeltjes uitmaakt, en een hydrofiele poly(ethylene glycol) (PEG) blokkeren, dat vormt de polymeer-borstel en Imparts sterische stabilisatie4,5.

Nanoprecipitation is een gemeenschappelijk fabricage techniek voor polymere nanodeeltjes omdat het eenvoudig en niet energie intensieve6. In zijn eenvoudigste vorm impliceert nanoprecipitation toevoeging Pipetteer van NP componenten in een organische oplosmiddelen zoals aceton tot een overmatige hoeveelheid stirred water. De verandering in oplosmiddel een verdunde waterige oplossing resulteert in het neerslaan van de onoplosbare kernonderdeel. De stabilisator assembleert op deze groeiende deeltje oppervlak, geregisseerd door adsorptie van de samengevouwen hydrofobe blok7,8,9,10. Een uniforme korrelgrootteverdeling wordt verkregen wanneer het oplosmiddel en water snel mengen tot een homogene oplossing vormen. Mengen die is langzamer dan de nucleatie en assemblage van de resultaten van de componenten in een grotere, meer polydisperse deeltjes bevolking. Hoewel gemakkelijk toegankelijk zijn voor een eenvoudige test, de stirred batch-aanpak resulteert in brede variabiliteit toe te schrijven aan de vermenging van inconsistentie en is niet vatbaar voor schaal-up6,11. Microfluidics opgedoken als een andere weg naar NP productie die continu kan worden uitgevoerd. Dit betekent voor productie is onlangs beoordeeld door Ding et al. 11 . Een gemeenschappelijke aanpak gebruikt laminaire flow gericht ter vermindering van de omvang van het oplosmiddel lengte sub micron waarden. Mengen van de antisolvent vindt plaats door diffusie, zodat kleine stroom afmetingen zijn van cruciaal belang om uniforme deeltjes11,12. Paralellisatie van meerdere microfluidic kamers voor schaal-up is problematisch voor grote productievolumes.

De snelle mengen voorwaarden die uniforme nanoprecipitation in microfluidics gunst kunnen afwisselend worden geproduceerd in afgesloten, turbulente stromen. Flash NanoPrecipitation (FNP) maakt gebruik van speciale mengen geometrieën om deze voorwaarden hogere volumetrische debieten dan mogelijk met microfluidics. Stromen van de inlaat Geef een mengkamer onder turbulente omstandigheden die tot de generatie van wervelingen leiden, zodat oplosmiddel/anti-solvent lamellen op de schaal van de lengte van diffusie11,13 vormen. Dus, uniforme mengen op een tijdschaal korter dan nucleatie en groei van de therapeutische wordt bereikt. De beperkte geometrie van de mixer staat niet toe dat stroom omzeilen van de regio waar turbulente energie dissipatie optreedt en het hele systeem ervaart het zelfde proces geschiedenis13. Nucleatie treedt op uniforme wijze in de mengkamer en deeltje groei verloopt tot tegengehouden door de vergadering van de BCP naar de oppervlakte9,14. De gemengde gegevensstroom met stabiele deeltjes kan vervolgens worden verdund met extra antisolvent om te onderdrukken Ostwald rijpen van de deeltjes15,16,17.

Een beperkt impinging jet (CIJ) mixer is het eenvoudigste mixer ontwerp voor de FNP en vergunningen vermenging van twee stromen in een schaalbare en continue mode, zoals afgebeeld in figuur 1A13. Een multi inlaat vortex-mixer (MIVM) werd ontwikkeld om maximaal vier verschillende stream ingangen terwijl nog het bereiken van de snelle micromixing vereist voor uniforme deeltjesvorming, zoals weergegeven in figuur 1B18. FNP kunt eenvoudige formulering screening die gemakkelijk kan worden vertaald naar commerciële schaal productie. Het ononderbroken karakter van het proces hoeven grotere batch maten geen nieuwe schepen maar liever langer lopen tijden, waardoor eenvoudige vertaling naar kilogram-schaal productie in de dezelfde apparatuur-trein.

Hydrofiele stoffen zoals peptides en proteïnen (‘biologics’) kunnen ook worden ingekapseld in een proces genoemd inverse Flash NanoPrecipitation (iFNP). De techniek vereist een amfifiele BCP waar één blok is hydrofoob en de andere is een polyacid19. De eerste stap impliceert snelle vermenging van een dimethyl sulfoxide (DMSO) stroom met de biologische en de BCP tegen een lipofiele oplosmiddel zoals dichloormethaan of chloroform. Dit resulteert in de vorming van deeltjes gestabiliseerd met de hydrofobe blok borstel. Hier, zal een dergelijke architectuur worden betiteld als een ‘omgekeerde’ NP. De kern bevat de polyacid, die vervolgens ionically kruisverwijzende met behulp van een multivalent catie. Dit stabiliseert de deeltjes om tot een waterige omgeving in de vorm van deeltjes of PEG-gecoate nanodeeltjes worden verwerkt door technieken die zijn gemeld in de literatuur19,20,21.

Dit protocol kan worden gebruikt voor de productie van de lab-schaal van polymere core-shell nanodeeltjes encapsulating hydrofiele of hydrofobe verbindingen. De subsecties van het protocol vindt u instructies over het gebruik van beide klassen van de mixer – de CIJ en de MIVM. De lezer moet zitten kundig voor aanpassing van het protocol voor kernonderdelen van de roman en reproducibly genereren nanodeeltjes van een gewenste grootte met behulp van de juiste mixer voor de stream-ingangen. Drie voorbeeld formuleringen met behulp van de FNP en iFNP zijn hieronder weergegeven. Twee dienst de CIJ-mixer en een vereist de MIVM15,22. De eerste formulering blijkt inkapseling van een model hydrofobe samengestelde door FNP. De tweede formulering blijkt inkapseling van een model hydrofiele samengestelde door iFNP in een CIJ-mixer. De definitieve formulering vormt een voorbeeld voor de inkapseling van het eiwit door iFNP met behulp van een MIVM. Het protocol voor deze derde formulering beschrijft het gebruik van een kleine, draagbare MIVM aangeduid als de ‘μMIVM’. Het ontwerp van de mixer is kleiner te maken voor vereenvoudigde formulering screening, maar het schalen gedrag is goed begrepen en de mixer is niet een microfluidic apparaat22. Het laatste deel van het protocol bevat enkele notities over opschaling van lood formuleringen geïdentificeerd in screening. Deze formuleringen zijn bedoeld om toegangspunten voor het leren van het proces en daarom gebruiken niet-afbreekbare poly (styreen)-op basis van polymeren. De stabilisatoren van de alternatieve zijn beschreven in de literatuur, met een aantal biocompatibel commerciële opties beschikbaar14,23,24.

Protocol

1. de inkapseling van hydrofobe bestanddelen in polymere NPs met behulp van een Mixer CIJ Voorbereiden en reinigen van de apparatuur. Aanschaffen en valideren van een CIJ-mixer.Opmerking: Zie Aanvullende informatie sectie 1 voor de oriëntatie van de bouw. CAD-bestanden zijn eveneens beschikbaar als Aanvullende informatie . Vóór elk gebruik, ervoor zorgen dat alle armaturen op de mixer CIJ knus en de uitlaat slang is niet gebogen of geknepen. In een zuurkast, een 5 mL luer lock spuit met 2-3 mL oplosmiddel aan elke adapter van de inlaat te koppelen. Selecteer een oplosmiddel (b.v., aceton) dat alle verbindingen die onlangs gebruikt in de mixer zal schoon.Noot: Typische selecties zijn aceton of tetrahydrofuraan (THF). Alleen gebruik polypropyleen spuiten oplosmiddel compatibiliteitsproblemen zoals uitloging te vermijden. Gebruik geen spuiten met rubber O-ring afdichting plunjers. Stel de CIJ-vergadering over een afval container.Opmerking: Een kolf met een opening kleiner dan de CIJ lichaam werkt goed als dit de mixer ondersteunt en eenvoudige bediening van de spuiten. Gestaag drukken de plunjers van de spuit om de inhoud via de mengkamer over een paar seconden leeg. Verwijder de spuiten.Opmerking: Spuiten kunnen worden behouden en hergebruikt voor meerdere rondes van het schoonmaken tussen FNP runs. Droog de CIJ mixer internals met behulp van een N2 stroom. Een mannelijke luer-adapter op het einde van een N2 regel is effectief.Opmerking: Als de schoonmaak oplosmiddel niet vluchtige (bijvoorbeeld DMSO), herhaal stappen 1.1.3-1.1.5 met aceton of THF voordat u stap 1.1.6. Het is cruciaal voor het verwijderen van de resterende oplosmiddel voor run-to-run consistentie. Oplosmiddelen en antisolvent streams op doel composities voor te bereiden. Los de hydrofobe compound (d.w.z., vitamine E) in unstabilized THF bij 10 mg/mL in voldoende hoeveelheid om te voltooien van het gewenste aantal FNP runs. Voorbereiding van iets meer dan per run nodig.Opmerking: Andere oplosmiddelen kunnen worden gebruikt in deze stappen, vrijgesteld van de beperkingen in de sectie discussie. Als dienst THF, wordt stabilisator-vrije oplosmiddel aanbevolen omdat Butylhydroxytolueen lage oplosbaarheid in water heeft. Wees voorzichtig om te voorkomen peroxide opbouw (inclusief peroxide testen) en Let erop dat de lage niveaus van peroxiden met bepaalde NP-toepassingen interfereren kunnen (bijvoorbeeld bleken van kleurstoffen). Meng de oplossing van de vitamine E op een vortex-mixer tot het is opgelost.Opmerking: Voor sommige verbindingen, Bad ultrasoonapparaat voor 1-2 min kan helpen bij het genereren van een opgeloste oplossing. Het is belangrijk dat alle componenten van het NP moleculair zijn ontbonden. Los van de blok copolymeer stabilisator (dat wil zeggen, poly(styrene) -b- poly(ethylene glycol), PS1.6 k-b-PEG5 k) in THF bij 10 mg/mL ongeveer hetzelfde volume als in stap 1.2.1 om te vormen van de polymeeroplossing.Opmerking: Andere oplosmiddelen kunnen worden gebruikt, vrijgesteld van de beperkingen die zijn beschreven in de sectie discussie. Meng de polymeeroplossing met een vortex-mixer tot het is opgelost. Indien nodig, plaats u de oplossing in een ultrasoonapparaat bad gedurende 1-2 minuten om te helpen bij de ontbinding van de vaste stoffen.Opmerking: Het polymeer kan niet in een micellaire formulier. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) kunnen een nuttig instrument om te bepalen of een nieuwe samenstelling van de stream aan dit criterium voldoet. Het oplosmiddel input stream eerste pipetting 0,25 mL van de vitamine E-oplossing 5 mg/mL van zowel vitamine E en de stabilisator (50% vitamine E laden) bevattende in een centrifugebuis 1,5 mL maken. Pipetteer dan 0,25 mL van de polymeeroplossing in de dezelfde buis.Opmerking: Volumes groter dan 0,5 mL per run zijn haalbaar met verschillende spuit maten. Boven 10 mL invoervolume is het praktisch te gebruiken een spuitpomp. Meng goed op een vortex-mixer voor 5-10 s. optioneel, centrifugeren van de buis bij 1000 x g gedurende 5-10 s om te herstellen van een vloeistof vast aan het GLB, dat verbetert de reproduceerbaarheid tussen CIJ runs. Pipetteer 0.525 mL gedeïoniseerd water in een tweede 1,5 mL centrifugebuis als de antisolvent stream.Opmerking: Het is beter om overtollige antisolvent, die ervoor zorgt dat de stroom van het oplosmiddel nooit de mengkamer zonder antisolvent aanwezig wordt. In sommige gevallen waar zout oplosbaarheid in het oplosmiddel/antisolvent mengsel is geen belemmerende factor, kunnen gebufferde waterige systemen worden gebruikt. Pipetteer 4 mL gedeïoniseerd water in een flesje van 20 mL Scintillatie of andere geschikte container als een bad demping. Plaats een kleine magnetische roer bar in het flesje.Opmerking: De demping bad vermindert de rijping van het definitieve gehalte aan oplosmiddelen tot 10% verlagen door volume15,17Ostwald. Dit volume kan worden aangepast aan adres proces beperkingen en kan direct worden geschaald met input stream volume. NPs door FNP met behulp van de mixer CIJ produceren. Plaats de ampul Bad open demping onder de schoongemaakte CIJ mixer op een bord roer in een zuurkast. Een praktische configuratie maakt gebruik van een 50 mL reageerbuis rek blok ter ondersteuning van de CIJ-mixer met de flacon hieronder en de uitlaat slang geregisseerd in het flesje. Zie figuur 1A voor oriëntatie. Begin roeren de demping Bad via de magnetische roer bar bij ongeveer 75% max snelheid. Gebruik een polypropyleen spuit van 1 mL, uitgerust met een bot-tip-naald, trekken het volledige volume van de antisolvent buis.Opmerking: Gebruik geen spuiten die een rubberen O-ring afdichting bevatten Voorkom compatibiliteit zorgen. Voor grotere volumes van de inlaat, gebruikt u een gepaste afmetingen luer lock spuit. De uitlaat van de spuit moet worden gecentreerd op de as van de spuit of het zal unstable tijdens depressie. Zorgvuldig alle luchtbellen uit de spuit verwijderen en verwijder de botte uiteinde naald, verwijdering in een container slijpsel. Prime de plunjer zodat de stroom gewoon om de opening van de spuit gaat. De injectiespuit sluit aan op een van de CIJ inlaat hulpstukken. Herhaal de stappen 1.3.3-1.3.5 voor de oplosmiddelen oplossing. Snel, soepel en gelijkmatig drukken de spuiten op hetzelfde moment door het plaatsen van de bal van de hand, de palm van de hand, of elke één duim op de toppen van de plunjers afhankelijk van persoonlijke voorkeur. Het verzamelen van de uitlopende vloeistof in het flesje van de bad demping.Opmerking: Een 0,5 mL ingang moet worden depressief in minder dan 0,5 s. Gereserveerd de CIJ mixer met het spuiten nog steeds gehecht. Verwijder de roer bar en dop van het flesje, waarin nu de NP-dispersie met een kern-shell deeltje structuur (Figuur 1 c). Houd de mixer boven een container afval oplossing en verwijder de spuiten. De afvoer van het hold-up volume (ongeveer 0,25 mL) zal vervolgens uit. Verwijdering van de gebruikte injectiespuiten en herhaal de schoonmaak stap 1.1 voordat de volgende FNP proces.Opmerking: Laat niet het hold-up volume te legen in de flacon met de NPs als dit monster uniformiteit nadelig zullen beïnvloeden. Het uitvoeren van analyse en nabewerking van NP dispersie. Kenmerkend zijn voor de grootte van de NP met behulp van Distributielijsten, Pipetteer 100 μl van de verspreiding van de NP in een kunststof cuvette en toevoegen van 900 μL van de demping Bad oplosmiddel (bijvoorbeeld water).Opmerking: Kleinere volumes kunnen gebruikt worden voor kleinschalige cuvettes. Over het algemeen volstaat een 10-fold verdunning. Meng goed door pipetteren op en neer of door de milde schudden. Volg de instructies van de instrumentspecifieke voor het analyseren van het monster.Opmerking: Alternatieve karakterisering technieken zoals onderzoek naar de potentiële zeta of elektronenmicroscopie mogen worden verricht als vereist. De NP-dispersie kan worden verder zoals gedicteerd door de toepassing verwerkt en herzien in de sectie discussie. 2. de inkapseling van hydrofiele bestanddelen in omgekeerde NPs met behulp van een Mixer CIJ Bereiden van oplosmiddel, antisolvent, en doven oplossingen in de zuurkast. Voer de reiniging en voorbereiding procedures beschreven in stap 1.1, met behulp van DMSO als een oplosmiddel reinigings- en vast te houden aan de notitie in stap 1.1.6 te voltooien een tweede spoeling met THF. Los van de hydrofiele stof (d.w.z., maltodextrine (MD) met dextrose gelijkwaardig (DE) met 4-7, gemiddeld molecuulgewicht = 3,275 g/mol, “3 k MD”) in DMSO op 10 mg/mL in voldoende volume om het gewenste aantal FNP loopt.Opmerking: Andere oplosmiddelen kunnen worden gebruikt, vrijgesteld van de beperkingen die worden beschreven in de sectie discussie. Meng de maltodextrine-oplossing met een vortex-mixer tot het is opgelost. Indien nodig, plaats u de oplossing in een ultrasoonapparaat bad gedurende 1-2 minuten om te helpen bij de ontbinding van de vaste stoffen. Maken van een blok copolymeer stabilisator (dat wil zeggen, de poly(styrene) -b- poly (acryl zuur), PS5 k-b- PAA4.8 k) stockoplossing in THF 11.1 mg/ml ongeveer hetzelfde volume als in stap 2.1.2 vormen de polymeeroplossing .Opmerking: Andere oplosmiddelen en stabilisator concentraties kunnen worden gebruikt. DMSO kan gemakkelijk worden gebruikt als oplosmiddel in plaats van THF. Meng de polymeeroplossing met een vortex-mixer tot het is opgelost. Indien nodig, plaats u de oplossing in een ultrasoonapparaat bad gedurende 1-2 minuten om te helpen bij de ontbinding van de vaste stoffen.Opmerking: De ingang van het polymeer kan niet in een micellaire formulier. Distributielijsten kunnen worden gebruikt om te bepalen of een nieuwe samenstelling van de stream aan dit criterium voldoet. De oplosmiddelen stream input (0,5 mL) voor te bereiden door een combinatie van de volgende, in volgorde, in een centrifugebuis 1,5 mL: 0.250 mL van de 3 k MD-oplossing, 0.225 mL polymeeroplossing en 0,025 mL gedeïoniseerd water.Opmerking: Het watergehalte van deze stroom heeft een sterke invloed op de grootte van de NP en polydispersiteit. Het is over het algemeen het beste om te opereren in de 2.5-10 vol % bereik20. Waarden op het hoge einde van het bereik kunnen inkapseling van grotere molecuulgewicht verbindingen helpen. Meng goed op een vortex-mixer voor 5-10 s. Optioneel, centrifugeer de buis bij 1000 x g gedurende 5-10 s om te herstellen van een vloeistof vast aan het GLB, dat verbetert de reproduceerbaarheid tussen CIJ runs. Bereid een crosslinker oplossing van calciumchloride (CaCl2) (dihydraat) p.a. in methanol 25.0 mg/ml.Opmerking: De crosslinker zal worden toegevoegd bij een verhouding van 1:1 gratis aan de zure groepen in de PAA blok. Dienovereenkomstig aan te passen de concentratie als een andere crosslinker is gebruikt of als een verschillende PAA blok grootte of polymeer concentratie gebruikte20,21 is. Bereid de antisolvent stroom door pipetting 0,5 mL chloroform en 0,05 mL van de oplossing van crosslinker (0.55 mL totaal) in een microcentrifuge buis.Opmerking: Andere aanvaardbare antisolvents worden gedicteerd door de keuze van de copolymeren blok en bevatten meestal dichloormethaan of aceton. De crosslinker kan in plaats daarvan worden toegevoegd aan de demping bad, met extra veroudering van de NP-dispersie te voorzien in dwarslijn vorming20. Meng goed op een vortex-mixer voor 5-10 s. Optioneel, centrifugeer de buis bij 1000 x g gedurende 5-10 s om te herstellen van een vloeistof vast aan het GLB, dat verbetert de reproduceerbaarheid tussen CIJ runs. 4 mL van de antisolvent (d.w.z., chloroform) toevoegen aan een flesje van 20 mL Scintillatie vormen de demping bad. Plaats een kleine magnetische roer bar in het flesje.Opmerking: Dit volume kan worden aangepast aan adres proces beperkingen. Vul het protocol voor NP vorming zoals beschreven in stap 1.3. Het uitvoeren van analyse en nabewerking van NP dispersie. Kenmerkend zijn voor de grootte van de NP met behulp van Distributielijsten, Pipetteer 100 μl van de verspreiding van de NP in een cuvet van glas en toevoegen van 900 μL van het oplosmiddel gebruikt voor de demping bad. Meng goed door pipetteren op en neer of door lichte beweging van de Cuvet. Volg de instructies van de software voor het analyseren van het monster.Opmerking: Crosslinking van de NPs kan kwalitatief worden beoordeeld door DLS met behulp van een goed oplosmiddel zoals DMSO of dimethylformamide (DMF) als DLS verdunningsmiddel20. Deeltjes die stabiel kruisverwijzende zijn zal vertonen een autocorrelatiefunctie in het oplosmiddel met minimale verandering in de deeltjesgrootte. Slecht kruisverwijzende deeltjes zwellen en vertonen een zwakke autocorrelatiefunctie en verstrooiing sterkte21. Desgewenst voegt u een basis, zoals ammoniak, te rijden Ionische kleurverandering en versterken crosslinking in de kern van het deeltje toe. Eventueel bereid een 3.48 mg/mL oplossing van ammoniak in methanol gravimetrisch met behulp van ammoniumhydroxide-oplossing (meestal 30 wt % ammoniak). Voeg 50 l (dat wil zeggen, 0.6 equivalenten met betrekking tot de zure groepen op het polymeer) ontkleuring met roeren.Opmerking: De equivalenten kunnen worden aangepast indien gewenst door het variëren van ofwel de concentratie of de volume toegevoegd25. Optioneel, leeftijd maar liefst 30 min met milde roeren crosslinking optreden. Proces de NP-dispersie te produceren microdeeltjes of gecoate NPs zoals beschreven in de literatuur19,20,21. 3. de inkapseling van ovoalbumine in omgekeerde NPs met behulp van een μMIVM Oplosmiddel- en antisolvent oplossingen voor te bereiden. Bereid een oplossing van 50 mg/mL voor ovoalbumine in gedeïoniseerd water (“OVA”). 0.75 mL van oplossing A in een centrifugebuis 1,5 mL bereid door verdunnen 75 μL van de eicellen oplossing met 0.675 mL DMSO voor het genereren van een 5 mg/mL oplossing van eicellen in DMSO met 10% water in volume. Meng goed samen en centrifugeer kort zoals eerder is beschreven.Opmerking: Zie stap 2.1.6 met betrekking tot watereffecten. Zoals in vorige secties, kunnen de volumes oplossing omhoog of omlaag om fit materiële behoeften worden aangepast. Bereiden van oplossing B door ontbinding van de blok copolymeer stabilisator (dat wil zeggen, de poly(styrene) -b- poly (acryl zuur), PS5 k-b- PAA4.8 k) in DMSO bij 6 mg/mL. Meng goed en bewerk ultrasone trillingen ten te ontbinden indien nodig. Pipetteer 0,75 mL in een centrifugebuis 1,5 mL. Pipetteer in een centrifugebuis 1,5 mL 0,75 mL van THF (oplossing C). Pipetteer 1.85 mL chloroform (oplossing D) in een glazen Scintillatie ampul. Bereid een 60,0 mg/mL calciumchloride-dihydraat crosslinker oplossing in methanol. Meng met behulp van een vortex-mixer. Bereiden een 4.17 mg/mL ammoniumhydroxide-oplossing in methanol zoals beschreven in stap 2.3.4. 5,25 mL chloroform aan een centrifuge tube van 15 mL toevoegen als de demping bad. Voorbereiding van de vergadering van de mixer en staan. Verzamel de onderste ontvanger, mengen geometrie schijf, de bovenste schijf, de moersleutel moersleutel en een O-ring. Zie Figuur 2 voor schema van onderdelen en de mixer stand terminologie.Opmerking: Details over de bouw van de MIVM kunnen worden gevonden in Aanvullende informatie (afdeling 1) en in de literatuur22. CAD-bestanden zijn eveneens beschikbaar als Aanvullende informatie . Plaats de O-ring in de groef, ervoor te zorgen dat het goed past en dat er geen tekenen van slijtage of schade zijn.Opmerking: Normale werking zal leiden tot versleten of oplosmiddel-gezwollen O-ringen. Als de O-ring uitgerekt of vervormd wordt weergegeven, laat het aan de lucht droog ‘s nachts vóór gebruik. Als de shape niet ‘s nachts worden hersteld, beschikken over de O-ring. Houden een ruime voorraad, want dit een verbruikbare deel is. Zorgvuldig lijn de mengen openingen van de schijf met de pinnen op de bovenste schijf en druk op elkaar. Zorg ervoor dat de O-ring niet doet worden verplaatst door het controleren van dat de twee stukken zitten flush. De twee stukken omkeren en handmatig samenvoegen met de onderste ontvanger. Zorg ervoor dat de uitlaat buis montage heeft zijn losgemaakt, zodat het niet interfereert met volledige aanscherping van de schijf.Opmerking: Als de threading vangsten tijdens vergadering, zorgvuldig demonteren en toepast een voedsel – of farmaceutische-grade anti-seize op de threading Voorkom invreten. Na handmatige aanscherping, passen de moersleutel moersleutel aan de bovenste schijf haringen en zonder speling draai de vergadering. Draai vervolgens de uitlaat buis montage zodat het zit stevig tegen de onderz─│de van de mengen geometrie. Ervoor zorgen dat de hulpstukken van de spuit op de bovenste schijf knus. Plaats de geassembleerde mixer op de stand van de mixer zodat de uitlaat slang zich onder de steun plaat uitstrekt. Steun de mobiele plaat zodat het uit de weg van de werkplek is geschorst. Optioneel, als u wilt controleren mechanische stop uitlijning, eerste hechten de lege glas spuiten naar de mixer inhammen.Opmerking: Volumetrische debieten zijn gevarieerd met behulp van spuiten van verschillende vat diameters, aangezien de spuiten zijn depressief gelijktijdig op dezelfde lineaire snelheid. De eerste en laatste verticale hoogte moeten hetzelfde zijn voor alle spuiten en kunnen worden aangepast met behulp van stelschroeven de plunjer schacht22aangeboord. De mechanische stopt zorgen dat buitensporige schade aan het glas spuiten doet zich niet voor. Optioneel, komt lager de mobiele plaat dus dat is te rusten op de mechanische stopt. Ervoor zorgen dat deze worden uitgelijnd, zodat de plaat ook komt tot rust onmiddellijk voordat u contact opneemt met de lege spuiten (zoals te zien in Figuur 2). Optioneel, Los de mechanische stopt en verplaats, indien nodig. Verwijder de glas spuiten en reset van de mobiele plaat uit de weg.Opmerking: Voor bediening met kunststof spuiten, de mechanische stopt zijn niet vereist. Plaats het bad open demping onder de uitlaat slang te verzamelen het afvalwater. Oplossing A trekken in een gasdichte spuit van 1 mL met behulp van een naald botte uiteinde. Verwijder alle luchtbellen en vervreemden van de naald. De oplossing voor het einde van de spuit luer montage Prime. Herhaal dit proces voor de oplossingen B en C. Oplossing D trekken in een 2,5 mL gasdichte spuit met behulp van een naald botte uiteinde. Verwijder alle luchtbellen en vervreemden van de naald. De oplossing voor het einde van de spuit luer montage Prime.Opmerking: Deze volumes zijn geselecteerd zodat de eerste injectiespuit plunjer hoogten hetzelfde zijn. Als volumes worden gewijzigd, voldoen zij nog steeds aan deze eis van de hoogte. Het monteren van de vier spuiten op de mixer in een rechtsom mode in alfabetische volgorde. Zie figuur 1B voor definitieve uiterlijk en de oriëntatie van de spuit schematisch.Opmerking: Controleer of geen spuit hoogte van de anderen afwijkt is en desgewenst oplossen. Werking van de mixer en reiniging uitvoeren. Greep de dragende behuizing aan beide zijden van de mobiele plaat. Zet geen vingers op het gezicht van de onderkant van de behuizing omdat dit een snuifje gevaar tegen de mechanische stopt. Langzaam lager de mobiele plaat zodat het rust gelijkmatig maar nauwelijks aan te raken de spuiten. Gestaag en soepel drukken de plaat, die gericht zijn om de bewerking te voltooien in ongeveer 0,5-1 s voor deze volumes22streamen. Verwijderen en de demping Bad buis waarin nu de NP-dispersie van het GLB. Neem de mixer met het spuiten nog steeds gehecht en houd over een afval container. Verwijder de spuiten, waardoor het volume van de hold-up voor het afwateren in de container. Houd de mixer vergadering opwaartse en demonteren van de mixer met behulp van de moersleutel moersleutel. Met behulp van een spuitfles, spoel de uitlaat slang met verschillende milliliter oplosmiddel (bijvoorbeeld aceton) en droog met lucht of stikstof. Spoel de mengen geometrie met een goed oplosmiddel (b.v., gedeïoniseerd water of DMSO) en spoel na met aceton met behulp van verschillende milliliter van een spray fles. Droog met een stroom van lucht of stikstof. Spoel de O-ring in een stroom van gedeïoniseerd water en drogen met filtreerpapier. De bovenste schijf grondig met verschillende milliliter van aceton met behulp van een oplosmiddel fles tot visueel schoon te spoelen. Droog met een stroom van lucht of stikstof zowel het oppervlak en de armaturen van de spuit. Spoel elke injectiespuit met verschillende milliliter van een goed oplosmiddel (b.v., gedeïoniseerd water of aceton) van een oplosmiddel fles. Een laatste spoeling van verschillende milliliter van aceton toepassen en lucht droog zijn voordat het volgende gebruik. Na verwerking en analyse uit te voeren. 50 μl van de calciumchloride-dihydraat crosslinker oplossing dropwise al roerend toevoegen bij ongeveer 75% maximale snelheid. 50 μl van de ammoniakoplossing dropwise al roerend toevoegen op maximale snelheid van 75%. Leeftijd voor minstens 30 min. Karakteriseren de NP-grootte zoals beschreven in stappen 2.3.1 en 2.3.2. Proces de NP-dispersie te produceren microdeeltjes of gecoate NPs zoals beschreven in de literatuur19,20,21. 4. wijzigingen voor formulering Scale-up De oplosmiddelen en antisolvent oplossingen voor te bereiden zoals beschreven in stappen 1, 2 of 3 naar de gewenste samenstelling en bij voldoende volume voor de formulering van de vereiste grootte. Optioneel, indien nodig, reinigen en steriliseren van de mixer in plaats met behulp van een geschikte protocol voorafgaand aan NP vorming.Opmerking: Sequentiële gespoeld van CIP 100, water (tot neutrale pH), CIP 200, water (tot neutrale pH) en een geschikt oplosmiddel zijn tewerkgesteld in het verleden. Bovendien, kunnen steriele filters worden aangesloten op de inhammen van de mixer in gevallen waar de definitieve deeltjesgrootte sterilisatie uitsluit door filtratie. Laden van de oplossingen in gasdichte spuiten van geschikte volume en hechten van polytetrafluorethyleen (PTFE) buis met een luer-adapter gemonteerd op het einde. Handmatig prime de oplossingen aan het einde van de buis. Het spuiten in een spuitpomp laden en de spuiten hechten aan de inhammen van de mixer op de CIJ of de MIVM, zoals vereist.Opmerking: Als alternatief, flow controllers kunnen worden gebruikt op het lab of pilot schaal om grotere volume mogelijkheden dan een spuitpomp te verstrekken. Succesvolle operatie vereist een gestage stroom en voldoende daling van de druk, wat betekent dat hydrofoor vaartuigen met flow meting op het stopcontact de meest geschikte selectie voor grootschalige productie zijn. Plaats een collectie vaartuig met een demping bad van voldoende volume, indien nodig, onder de uitlaat slang. Het debiet aan degenen bereikt handmatig instellen (bijvoorbeeld over 30-60 mL/min per stream).Opmerking: Als de CIJ, het debiet van de pomp moet identiek. Als de MIVM gebruikt, kunnen verschillende inhammen verschillende debieten hebben. Gelijktijdig beginnen de pompen. Verzamelen van ongeveer 5-10 mL afvalwater als afval in een klein flesje (dit is een “start-up volume”) en vervolgens beginnen met het verzamelen in het bad demping. Karakteriseren en verwerken zoals beschreven in de overeenkomstige formulering sectie hierboven.

Representative Results

Screening van NP formuleringen met FNP is snelle en vereist kleine hoeveelheden materiaal (volgorde 1-10 mg). Het FNP-protocol om in te kapselen hydrofobe verbindingen zoals vitamine E (stap 1) resulteert in een stabiele, zuivere of licht opalen NP-dispersie. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) biedt een robuuste manier te karakteriseren de deeltjesgrootte. Zoals blijkt uit Figuur 3, levert het proces NPs met een lage polydispersiteit op een reproduceerbare wijze. De typische polydispersiteit index (PDI) is minder dan 0,20, die aangeeft een relatief monodispers bevolking. De PDI wordt verkregen uit de autocorrelatiefunctie en wordt vaak uitgevoerd in instrument software. Het is een verhouding van het tweede tot het eerste moment, waar waarden van 0.1 zijn over het algemeen verkregen voor monodispers deeltjes26. Voor de vier vitamine E/PS-b-PEG formulering replicatieonderzoeken gemeld, de waarde 0,12 ± 0,02 en de gemiddelde diameter was 107 ± 7 nm. Een typische “ontstekingsfouten” als gevolg van beide ongelijke depressie van het spuiten of depressie trager wordt ook vermeld in Figuur 3. De polydispersiteit was niet beïnvloed, maar de grootte was iets groter (135 nm). Met inbegrip van dit voorbeeld worden de nieuwe statistieken voor deeltjesgrootte 113 ± 14 nm. Een ontstekingsfouten resulteert in perioden waarin de kamer slechts een enkele gegevensstroom type bevat. Het is belangrijk dat de gehele stream de hetzelfde proces geschiedenis en de relatieve omvang van de biologische en waterige stromen binnen de mixer ervaringen. Zonder een stabilisator ontstaat een ondoorzichtig oplossing met zichtbaar aggregaten. De autocorrelatiefunctie van Distributielijsten voor dit voorbeeld is niet-monotone en doet niet soepel, zoals te zien in de Figuur 3 inzet verval. Deeltje grootte controle door FNP wordt geïllustreerd in Figuur 4, waar verschillende van de relatieve hoeveelheden van kernmateriaal – poly(styrene)1.8 k in dit geval- en PS -b-PEG stabilisator resulteerde in deeltjes grootte die van 49-152 nm varieerden. Deze deeltjesgrootte werden gegenereerd met THF streams met een totale massaconcentratie voor core en stabilisator van 20 mg/mL, waar 25%, 50% of 75% van de massa het kernmateriaal van de poly(styrene) was. De polydispersiteit van de nanodeeltjes was altijd minder dan 0,15. Uitgebreide discussie van parameter gevolgen voor de grootte van de deeltjes geproduceerd door FNP kan worden gevonden in de literatuur10. Het laden kan worden afgestemd door de constante oplosmiddel volume en de relatieve omvang van de kern en stabilisator voorraadoplossingen variërend. Evenzo kan de totale massaconcentratie worden gevarieerd door het opstellen van stamoplossingen op andere waarden dan 10 mg/mL. Onder bepaalde voorwaarden is het mogelijk om te observeren een lege micel bevolking door DLS27. Dit heeft geen nadelig effect dan de verbreding van de gemeten korrelgrootteverdeling. Wanneer de maten lijken, kan dit manifesteren als een enkele brede piek in plaats van twee aparte pieken. De dezelfde CIJ mixer kan ook worden gebruikt om in te kapselen hydrofiele verbindingen door iFNP, zoals in stap 2 van het Protocol. De deeltjes die zijn geproduceerd in de gerapporteerde formulering zijn ongeveer 65 nm met een lage polydispersiteit van 0,08. De grootteverdeling kan worden gezien in figuur 5A (onderbroken lijnen). Het effect van crosslinking de PAA carbonzuur residuen op deeltje stabiliteit wordt aangetoond door DLS analyse in een sterk solvent zoals DMSO, zoals weergegeven in figuur 5B. De autocorrelatiefunctie voor goed-kruisverwijzende deeltjes moet beginnen in de buurt van een waarde van 1 en neerzetten sterk op 0 op een karakteristiek moment dat is gerelateerd aan de grootte van de deeltjes (vaste lijn). Deeltjes die uitgebreid zwellen of ontbinden zijn niet kruisverwijzende en Toon van minimale autocorrelatie signaal (gestippelde lijn). Voor iFNP, mislukte proeven manifesteren op vergelijkbare wijze als beschreven voor het FNP hierboven. Zichtbaar aggregaten kunnen worden beschouwd of slechte DLS autocorrelatie functie vorm kan worden waargenomen. De MIVM kan worden gebruikt voor de FNP of iFNP wanneer meer dan twee inlaat streams vereist vanwege de beperkingen van het systeem zoals oplosbaarheid of chemische onverenigbaarheid zijn. Een kleine versie van de MIVM (de μMIVM) met een mixer stand is afgebeeld in Figuur 2. Net als bij de CIJ, kan deze mixer worden gebruikt om in te kapselen hydrofobe en hydrofiele verbindingen22. In stap 3, werd een protocol voor de inkapseling van een hydrofiele proteïne, eicellen, door iFNP beschreven. De korrelgrootteverdeling is afgebeeld in figuur 5A (vaste lijn). De grootte is ongeveer 125 nm met een PDI van 0.16. Een algemeen protocol voor spuit pomp exploitatie op grotere schaal wordt verstrekt in stap 4. Figuur 1: Mixer vergadering en doorstroom patroon schema. (A) de beperkte inbreuk jets (CIJ) mixer met bijgevoegde spuiten is gepositioneerd boven het bad demping. Niet afgebeeld zijn een roer-bar in het flesje van de bad demping en een roer-plaat. De mixing geometrie wordt afgebeeld in de uitgebreide weergave van de twee stream inhammen die van invloed zijn in het midden van de kamer. (B) een multi inlaat vortex-mixer (de μMIVM) wordt weergegeven met glas spuiten en geplaatst in de standaard boven een bad demping. De mobiele plaat en de mechanische stopt hebt van de foto is bijgesneden. De uitgebreide weergave toont schematisch de vortex-kamer en de inlaat kanalen. (C) A schematische weergave van core-shell NPs geproduceerd door FNP. Rode bollen vertegenwoordigen de therapeutische, die in combinatie met de blauwe samengevouwen polymeer blok, omvatten de NP-kern. Het gele polymeer blok vormt de borstel laag meegeven van sterische stabilisatie aan het NPs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: μMIVM terminologie en onderdelen voor montage. De μMIVM vereist een stand mixer om uniforme depressie van de vier spuiten. In dit geval moet de hoogten van de plunjer spuit alles uniform om ervoor te zorgen consequent mengen. Het kan als alternatief worden bediend met behulp van de injectiespuit pompen. De stand van de mixer met gelabelde componenten wordt weergegeven aan de linkerkant van de figuur. Aan de rechterkant is de gedemonteerde mixer met de O-ring in plaats op de schijf meetkunde mengen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: Particle size distributie van polymere nanodeeltjes met een kern van vitamine E en gestabiliseerd door PS -b-PEG. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) biedt intensiteit-gewogen grootte distributies die aangeven van de verdeling van de diameter NP. Curven zijn het gemiddelde van de drievoudige analyses voor elk afzonderlijk experiment en hebben om te produceren van identieke maximale piekhoogte schaal gebracht zijn weglating. De vier replicatieonderzoeken (ononderbroken lijnen) geven de hoge reproduceerbaarheid van de methode (standaarddeviatie = 7 nm). Ook inbegrepen is een representatieve ontstekingsfouten (gestippelde lijn), zoals de lagere snelheid van de spuit of ongelijke depressie van de twee spuiten, wat in grotere deeltje diameter resulteert. De standaarddeviatie van de grootte van de NP inclusief de ontstekingsfouten werd 14 nm. (Inzet) Zonder de PS -b-PEG stabilisator, grote micron-schaal aggregaten (of druppels, in het geval van een olie zoals vitamine E) worden gevormd. De autocorrelatiefunctie DLS van een lopen zonder de stabilisator (gestippelde lijn) wordt getoond samen met een vertegenwoordiger autocorrelatie van een kopie van de nanoparticle (vaste lijn). De autocorrelatiefunctie toont een aantal karakteristieke termijnen voor de controlemonster, die een bevolking van polydisperse aangeeft. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: deeltje grootte controle door FNP via variërend van relatieve verhoudingen voor core materiaal aan stabilisator. De intensiteit-gewogen grootte verdelingen van drie formuleringen met een poly(styrene)-kern gestabiliseerd door PS -b-PEG worden afgebeeld. De totale massaconcentratie in THF was 20 mg/mL en de antisolvent water. De formuleringen werden voorbereid in een CIJ-mixer. De Fractie van de massa bestaat uit het kernmateriaal wordt vermeld in de legenda. Bijvoorbeeld, het monster 25% kern bevat 5 mg/mL poly(styrene) en 15 mg/mL PS -b-PEG. De gemiddelde grootte van 25% (vaste lijn), 50% (gestippelde lijn), en 75% (gemengde dash lijn) kern belastingen werden 49 nm, 96 nm, en 152 nm, respectievelijk. Alle PDI waarden waren minder dan 0,15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: karakterisering van omgekeerde NPs gemaakt in een CIJ mixer of μMIVM. (A) DLS curven zijn het gemiddelde van de drievoudige analyses voor elke formulering. De onderbroken lijn geeft de grootteverdeling van 3 k MD deeltjes in de mixer CIJ gemaakt terwijl de ononderbroken lijn de grootteverdeling van eicellen deeltjes gemaakt in de μMIVM is. (B) de kracht van crosslinking kan worden beoordeeld door DLS gebruik van DMSO als het oplosmiddel. De autocorrelatiefunctie DLS geeft aan de kracht van crosslinking door middel van de waarde van de eerste autocorrelatie en de observatie van een schone overgang naar een waarde van nul. De gestreepte lijn toont de autocorrelatiefunctie voor een deeltje met geen crosslinker met een zwak eerste signaal en een brede verval-tijd. De ononderbroken lijn toont de autocorrelatie na toevoeging van een sterke crosslinker (in dit geval, tetraethyleenpentamine), waaruit een sterke eerste signaal en een gedefinieerde verval tijdschaal blijkt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6: oververzadiging, S, als een functie van de relatieve mengverhoudingen van organisch oplosmiddel water. (A) vergelijking van hoogste haalbare oververzadiging voor (○) boscalid, bestrijdingsmiddelen en (■) peptide B, een zeven-residu model peptide. De organische stream bevat boscalid bij een concentratie van 230 mg/mL en peptide B 200 mg/ml, hun concentraties van verzadiging. Er is een maximale oververzadiging dat afhangt van elk actief farmaceutisch ingrediënt (API) / oplosmiddel systeem. (B) wanneer de concentratie van boscalid in de organische stroom 20-fold wordt verlaagd, de voorwaarden waartegen oververzadiging en nanoprecipitation worden verkregen worden beperkt. Dit cijfer is herdrukt met toestemming van Elsevier9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De inkapseling van hydrofobe verbindingen zoals vitamine E, zoals in stap 1 van het Protocol is uitgebreid beschreven9,14,28. Relatief worden monodispers deeltjes geproduceerd, omdat de tijdschaal voor het mengen korter dan de tijdschaal voor de aggregatie en de groei van de deeltjes is. In het bijzonder de gemengde oplosmiddel/antisolvent oplossing wordt snel homogene, waardoor nucleatie uniform optreden. Vergadering van de blokcopolymeer aan de oppervlakte van de deeltjes vervolgens biedt sterische stabilisatie dat deeltje groei5stopt. Aangezien tijd te mengen in de kamer (turbulentie) een functie van de stroomsnelheid van de inham naar de CIJ of de MIVM is, is er een inlaat-tarief, dat na de overgang naar het turbulente menging plaatsvindt, waar de deeltjesgrootte is in wezen constante13. Dit biedt extra robuustheid aan het proces zoals sommige–charges variatie in debiet van de inlaat (d.w.z., spuit depressie snelheid) zonder significante invloed op het uiteindelijke formaat van de NP kan worden getolereerd, zoals blijkt uit Figuur 3. Langzamer of ongelijke inlaat snelheden kunnen leiden tot grotere deeltjes of meer polydisperse distributies, zoals bijvoorbeeld de ontstekingsfouten gezien. FNP is ook uitgebreid kapselen hydrofiele bestanddelen in nanodeeltjes door inverse Flash NanoPrecipitation. Deze omgekeerde nanodeeltjes kan dan worden gebruikt om microdeeltjes maken of worden bekleed met PEG maken water verspreidende nanodeeltjes25. De onderliggende principes van de vergadering blijven hetzelfde, al is er de toegevoegde complexiteit van crosslinking de kern van het deeltje. Dit is nodig voor de stabilisatie van het deeltje in een waterige omgeving. In het algemeen, is een heffing van 1:1 verhouding ten opzichte van het polyacid blok voldoende, hoewel de Ionische interacties kunnen worden bevorderd door de pH-waarde door de toevoeging van een base19. In dit protocol is slechts de eerste processtap naar formulier omgekeerde NPs beschreven.

Naast het snelle mixen is succesvolle formulering door FNP of iFNP beperkt tot gevallen waarbij verschillende voorwaarden voldaan9,14 zijn kunnen. Eerst alle ingangen streamen moet mengbaar. Hoewel emulsies zijn gebruikt voor de productie van de NPs, vereist FNP een uniforme oplossing fase in de mixer. Ten tweede, de belangrijkste component moet bijna onoplosbare op de oplosmiddelen omstandigheden in de mixer (voor de CIJ, een 50/50 mengsel volumeprocent) snelle nucleatie rijden. Anders, een aanzienlijk deel blijft unencapsulated of neerslaat na verdere verdunning met antisolvent. De MIVM kunnen hogere antisolvent inhoud in de mengkamer adres kern oplosbaarheid in materiële beperkingen. Het is vaak nuttig voor het genereren van oververzadiging curven van oplosbaarheid gegevens als een functie van oplosmiddelen samenstelling te begeleiden proces ontwerp9. Figuur 6 toont representatieve curven voor twee verbindingen. Lage oververzadiging op de mengen kamer voorwaarden verdiensten op verschillende composities, meestal met behulp van de MIVM. Hogere oververzadiging gunsten de nucleatie van het kernonderdeel over deeltje groei maar een mismatch in montagetijd van het kernmateriaal en de stabilisator kan leiden tot grote aggregaten van de therapeutische. D’Addio en Prud’homme hebben herzien de toepassing van dergelijke oververzadiging curven in detail9. Tot slot de BCP moleculair moet worden opgelost in het oplosmiddel stream en de antisolvent stroom moet selectief voor één blok. De gedragscode moet voldoende amfifiele te bieden beide een solvophobic drijvende kracht van de samengevouwen blok aan de stabilisator op het oppervlak van de deeltjes en voor het blok van de solvated om hieraan sterische stabiliteit om het deeltje te verankeren. Oplosmiddelen dan beschreven in het protocol kunnen worden gebruikt, zolang ze voldoen aan deze beperkingen.

Praktijk met handmatige spuit bewerking kunt verbeteren het slagingspercentage tijdens screening. Zoals hierboven vermeld, betekent bewerking boven de overgang naar homogene, turbulente mengen voorwaarden dat kleine variaties in het debiet in de proces28worden getolereerd. Schaal-up pomp-aangedreven, computergestuurde stromen resultaten in nog grotere winsten in samenhang als gevolg van de stroomsnelheid reproduceerbare inlaat. Op elk moment tijdens de nabewerking van de deeltjes, kan visuele inspectie of DLS analyse wijzen de aanwezigheid van grote aggregaten die als gevolg van incidentele instabiliteit van de stof of deeltjes kunnen. Indien nodig, kan de stroom worden gefilterd met een poriegrootte van het gewenste filter. In de afwezigheid van aggregaten, hebben we gevonden die minder dan 5% massa meestal verloren is bij het filteren van PEG-gecoate nanodeeltjes als de nominale filter grootte groter dan de korrelgrootteverdeling is. Bij het filteren van aggregaten, is experimentele bepaling van de massa verloren tijdens het proces nodig. Kwantificering van de massa verlies kan op twee manieren worden uitgevoerd. De massa van de totale hoeveelheid deeltjes in een bepaald volume kan worden bepaald door Thermogravimetrische analyse vóór en na de filtratie om te identificeren welke wijziging (Zie Aanvullende informatie sectie 2). Als alternatief, de deeltjes kunnen herstelde (bijvoorbeelddoor lyofilisatie) en opgelost in een goed oplosmiddel. De concentratie van het kernmateriaal kan dan rechtstreeks worden gemeten door een passende techniek zoals UV-zichtbaar spectrofotometrie of chromatografie.

Voor de FNP, moet de resterende 10 vol % organisch oplosmiddel (bijvoorbeeldTHF) worden verwijderd uit de waterige dispersie. Dit kan gebeuren door de verdampingsemissie distillatie14,29, dialyse30of31,32van de filtratie van de tangentiële stroom. Praktische overwegingen voor elke stap worden beschreven in de citaties geleverd. Voor dialyse zijn typische membranen 3,5 kDa of 6-8 kDa cutoffs, hoewel grotere opties beschikbaar zijn. Deze moleculair gewicht cutoff is voldoende voor oplosmiddelen verwijderen wanneer dialyzed gedurende 24 uur met behulp van de diverse Bad-wijzigingen. Het gebruik van tangentiële stroom filtratie houdt sommige procesontwikkeling zoals zorg moet worden genomen om te voorkomen dat inducerende aggregatie als gevolg van concentratie polarisatie aan de oppervlakte van het membraan. We hebben vastgesteld dat de vermindering van de organische oplosmiddelen samenstelling onder een systeemafhankelijke waarde, meestal 2-10 vol %, aggregatie aan de oppervlakte van het membraan elimineert. Na verwerking, is de concentratie van nanodeeltjes gemakkelijk bepaald door Thermogravimetrische analyse (Zie Aanvullende informatie sectie 2). Vaak is het wenselijk te vervoeren of opslaan van deeltjes in een zeer stabiele vorm. Waterige dispersies kunnen eenvoudig worden bevroren snel met behulp van een droog ijs/aceton mengsel en vervolgens opgeslagen bij-80 ° C. U kunt ook droge poeders kunnen worden verkregen door lyofilisatie33,34 of spray drogen24. Een cryoprotectant moet vaak worden toegevoegd aan het verminderen van nanoparticle aggregatie tijdens bevriezing of drogen. Suikers (sucrose, trehalose, enz.), poly(ethylene glycol) of Cyclodextrine kan worden gescreend voor effectiviteit meer dan een aantal uiteenlopende concentraties door grootte toezicht door DLS35,36,,37, 38. Gemeenschappelijke NP stabiliteitsproblemen tijdens de verwerking zijn vaak gerelateerd aan oplosbaarheid of fase-scheiding in de kern resulterend in omlegging naar een lagere energie staat onder omstandigheden waar de mobiliteit is toegenomen. Gebruik van co kern materialen, de stabilisatoren van de alternatieve of gemodificeerde externe oplossing samenstelling kan helpen verbeteren van stabiliteit14,16,17,39,40, 41.

Zoals hierboven vermeld, kan de MIVM hoger antisolvent gehalte in de mengkamer wanneer vereist hoge oververzadiging bereikt. Het kan ook zorgen voor de fysieke scheiding van soorten in meer dan twee stromen wanneer reactiviteit of oplosbaarheid beperkingen vereisen. Een voorbeeld is de vorming van zein eiwit-gestabiliseerde nanodeeltjes van de antibiotica clofazimine24. De hydrofobe clofazimine wordt ingevoerd in een stroom van aceton; Zeïne is geïntroduceerd in een ethanolische waterige stream van 60%; caseïne, welke complexen met zein, gebracht met een waterige buffer stream, en de vierde stream is extra buffer te verhogen van de verhouding van water naar aceton en ethanol. Twee oplosmiddel stromen zijn vereist, aangezien clofazimine en zein, niet oplosbaar in een gemeenschappelijk oplosmiddel zijn. Dit proces kan niet worden bereikt in een twee-jet CIJ mixer. Deze eiwit-gestabiliseerde formulering toont ook aan dat de FNP niet beperkt tot de stabilisatoren van de BCP is. Janus deeltjes zijn geproduceerd zonder stabilisator42 en allerlei goedkope stabilisatoren voor mondelinge toepassingen24hebben aangetoond. Copolymeren zoals hydroxypropyl methylcellulose kunnen met name worden gebruikt in plaats van blok copolymeren24. Core materiaal kunnen meer hydrofobe worden gemaakt door een aantal technieken. Hydrofobe ion koppeling is toegepast om een breed scala van verbindingen die tussenliggende oplosbaarheid43,44,45kapselen. Zeer hydrofobe prodrugs geweest gegenereerd en vervolgens ingekapseld46. Nucleic zuren hebben is ingekapseld door complexvorming met kationische lipiden47. Nog belangrijker is, hebben deze studies aangetoond dat de FNP allerlei deeltje oppervlakte chemicaliën kan produceren. Verdere, gemengde stabilisatoren met een fractie van BCP is gewijzigd met een targeting ligand op het einde van de keten werden gebruikt. Hierdoor is nauwkeurige controle over ligand-inhoud op het oppervlak omdat deeltjes samenstelling een afspiegeling de input stream samenstelling23,48 vormt. Ook is het mogelijk om meerdere componenten van de kern, met inbegrip van verfstoffen en anorganische nanodeeltjes3,8.

Flash NanoPrecipitation is een schaalbare benadering polymere nanodeeltjes bestaat uit een hydrofobe of een hydrofiele kern. Als de hierboven opgesomde criteria wordt voldaan, wordt over het algemeen meer dan 95% van het kernmateriaal ingekapseld in hoge massafractie in het deeltje. De drie voorbeelden die hier gepresenteerd werden uitgevoerd op Bank schaal, vereisen een paar milligram van materiaal en ongeveer 0,5 mL in elke inlaat stream. Dit zorgt voor een snelle screening van deeltje voorwaarden voor de optimalisering van de formulering. Opschalen van lood formuleringen tot grotere batch maten is een kwestie van het runnen van het proces langer, dat gemakkelijk kan worden bereikt door het gebruik van de injectiespuit pompen of flow controllers. Daarentegen, uitdagingen de opschaling van bulk toevoeging nanoprecipitation goed gedocumenteerd in het behoud van voldoende micromixing op het punt van toevoeging en -accounting voor vaartuig geometrie49wordt gewijzigd. Dit vormt een grote barrière, aangezien het is van cruciaal belang voor de vervaardiging van deeltjes op een consistente manier om te voldoen aan de FDA vereisten50. Microfluidics technieken kunnen produceren ook uniforme, reproduceerbare nanodeeltjes, maar alleen inschakelen voor productie in het bereik van milligram. Bijvoorbeeld, meldde Karnik et al. productie tarieven van 0,25 mg/min voor een drug-release studeren51. Verdere schaalvergroting impliceert meestal paralellisatie bij hoge capital kost12. Met FNP is het eenvoudig om te produceren van 1 gram van nanodeeltjes op 600 mg/min met een spuitpomp en een paar hulpstukken verbinden met de mixer inhammen. Bijgevolg, FNP vertegenwoordigt zowel een gereedschap toegankelijk lab-schalen screening evenals een schaalbare aanpak voor de NP productie voor translationeel werk.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de Optimeos Life Sciences, de National Science Foundation (CBET 1605816), de Bill en Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) en de National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1656466) toegekend aan K.D.R.

Materials

Confined Impinging Jets Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Luer fitting Idex Health & Science P-604 Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads
Plug fitting Idex Health & Science P-309 Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Outlet fitting – CIJ Idex Health & Science P-205 Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet ferrule – CIJ Idex Health & Science P-200 Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet tubing – CIJ Idex Health & Science 1517 Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber
Tetrahydrofuran (THF) Fisher Scientific T425-4 Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.
Norm-ject syringe (3 ml) VWR 53548-017
Vitamin E (α-tocopherol) Sigma-Aldrich 90669-50G-F Store cold
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k Polymer Source P13141-SEO Other block sizes acceptable depending on application
poly(styrene)1.8k Polymer Source P2275-S Example hydrophobic core material
Scintillation vial DWK Lifesciences 74504-20
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk) National S7510-1
Maltodextrin DE 4-7 Sigma-Aldrich 419672-100G
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k Polymer Source P5917-SAA Other block sizes acceptable depending on application
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D159-4
Calcium chloride dihdyrate Sigma-Aldrich 223506-25G Hygroscopic.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific AC423300250
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA) Sigma-Aldrich A5503-1G
Multi-Inlet Vortex Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Outlet fitting – MIVM Idex Health & Science P-942 Combination with ferrule
Outlet tubing – MIVM NA NA Fit to ferrule ID.
O-ring (MIVM) C.E. Conover MM1.5 35.50 V75 Order bulk – consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Mixer stand NA NA See Markwalter & Prud'homme for design.17
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Bobo, D., Robinson, K. J., Islam, J., Thurecht, K. J., Corrie, S. R. Nanoparticle-Based Medicines: A Review of FDA-Approved Materials and Clinical Trials to Date. Pharmaceutical Research. 33 (10), 2373-2387 (2016).
  2. D’Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
  3. Gindy, M. E., Prud’homme, R. K. Multifunctional nanoparticles for imaging, delivery and targeting in cancer therapy. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (8), 865-878 (2009).
  4. Chen, G., Roy, I., Yang, C., Prasad, P. N. Nanochemistry and Nanomedicine for Nanoparticle-based Diagnostics and Therapy. Chemical Reviews. 116 (5), 2826-2885 (2016).
  5. Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Mechanism for Rapid Self-Assembly of Block Copolymer Nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302-118302 (2003).
  6. Schubert, S., Delaney, J. J. T., Schubert, U. S. Nanoprecipitation and nanoformulation of polymers: from history to powerful possibilities beyond poly(lactic acid). Soft Matter. 7 (5), 1581-1588 (2011).
  7. Lebouille, J. G. J. L., Stepanyan, R., Slot, J. J. M., Cohen Stuart, M. A., Tuinier, R. Nanoprecipitation of polymers in a bad solvent. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 225-235 (2013).
  8. Akbulut, M., et al. Generic method of preparing multifunctional fluorescent nanoparticles using flash nanoPrecipitation. Advanced Functional Materials. 19 (5), 718-725 (2009).
  9. D’Addio, S. M., Prud’homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (6), 417-426 (2011).
  10. Pagels, R. F., Edelstein, J., Tang, C., Prud’homme, R. K. Controlling and Predicting Nanoparticle Formation by Block Copolymer Directed Rapid Precipitations. Nano Letters. 18 (2), 1139-1144 (2018).
  11. Ding, S., Anton, N., Vandamme, T. F., Serra, C. A. Microfluidic nanoprecipitation systems for preparing pure drug or polymeric drug loaded nanoparticles: an overview. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (10), 1447-1460 (2016).
  12. Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
  13. Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE Journal. 49 (9), 2264-2282 (2003).
  14. Saad, W. S., Prud’homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  15. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  16. Kumar, V., Wang, L., Riebe, M., Tung, H. H., Prud’homme, R. K. Formulation and stability of itraconazole and odanacatib nanoparticles: Governing physical parameters. Molecular Pharmaceutics. 6 (4), 1118-1124 (2009).
  17. Liu, Y., Kathan, K., Saad, W., Prud’homme, R. K. Ostwald Ripening of β -Carotene Nanoparticles. Physical Review Letters. 98 (3), 036102-036102 (2007).
  18. Liu, Y., Cheng, C., Liu, Y., Prud’homme, R. K., Fox, R. O. Mixing in a multi-inlet vortex mixer (MIVM) for flash nano-precipitation. Chemical Engineering Science. 63, 2829-2842 (2008).
  19. Pagels, R. F., Prud’homme, R. K. Polymeric nanoparticles and microparticles for the delivery of peptides, biologics, and soluble therapeutics. Journal of Controlled Release. 219, 519-535 (2015).
  20. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Ch. 11. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , 249-274 (2017).
  21. Markwalter, C. E., Prud’homme, R. K. Ch. 12. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , 275-296 (2017).
  22. Markwalter, C. E., Prud’homme, R. K. Design of a Small-Scale Multi-Inlet Vortex Mixer for Scalable Nanoparticle Production and Application to the Encapsulation of Biologics by Inverse Flash NanoPrecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (9), 2465-2471 (2018).
  23. Gindy, M. E., Ji, S., Hoye, T. R., Panagiotopoulos, A. Z., Prud’Homme, R. K. Preparation of poly(ethylene glycol) protected nanoparticles with variable bioconjugate ligand density. Biomacromolecules. 9 (10), 2705-2711 (2008).
  24. Zhang, Y., et al. Design and Solidification of Fast-Releasing Clofazimine Nanoparticles for Treatment of Cryptosporidiosis. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3480-3488 (2017).
  25. Pagels, R. F. . Polymeric Nanoparticles and Microparticles for the Delivery of Hydrophobic and Hydrophilic Therapeutics. , (2018).
  26. Frisken, B. J. Revisiting the method of cumulants for the analysis of dynamic light-scattering data. Applied Optics. 40 (24), 4087-4091 (2001).
  27. Budijono, S. J., Russ, B., Saad, W., Adamson, D. H., Prud’homme, R. K. Block copolymer surface coverage on nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 360 (1-3), 105-110 (2010).
  28. Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Flash NanoPrecipitation of Organic Actives and Block Copolymers using a Confined Impinging Jets Mixer. Australia Journal of Chemistry. 56, 1021-1024 (2003).
  29. Kumar, V., Prud’homme, R. K. Nanoparticle stability: Processing pathways for solvent removal. Chemical Engineering Science. 64 (6), 1358-1361 (2009).
  30. Shi, L., Shan, J., Ju, Y., Aikens, P., Prud’homme, R. K. Nanoparticles as delivery vehicles for sunscreen agents. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 122-129 (2012).
  31. Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of Diafiltration and Tangential Flow Filtration for Purification of Nanoparticle Suspensions. Pharmaceutical Research. 22 (12), 2152-2162 (2005).
  32. Pansare, V. J., Tien, D., Thoniyot, P., Prud’homme, R. K. Ultrafiltration of nanoparticle colloids. Journal of Membrane Science. 538, 41-49 (2017).
  33. D’Addio, S. M., et al. Novel Method for Concentrating and Drying Polymeric Nanoparticles: Hydrogen Bonding Coacervate Precipitation. Molecular Pharmaceutics. 7 (2), 557-564 (2010).
  34. Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1688-1713 (2006).
  35. Correa, S., et al. Highly Scalable, Closed-Loop Synthesis of Drug-Loaded, Layer-by-Layer Nanoparticles. Advanced Functional Materials. 26 (7), 991-1003 (2016).
  36. Figueroa, C. . Engineering Nanoparticles for Pharmaceutical Applications: Formulation and Freeze-drying Techniques. , (2014).
  37. Harada, A., Li, J., Kamachi, M. Preparation and properties of inclusion complexes of polyethylene glycol with alpha-cyclodextrin. Macromolecules. 26 (21), 5698-5703 (1993).
  38. Troiano, G., Song, Y. -. H., Zale, S., Wright, J., Van Geen Hoven, C. Stable Formulations for Lyophilizing Therapeutic Particles. United States patent. , (2013).
  39. Kumar, V., Adamson, D. H., Prud’homme, R. K. Fluorescent polymeric nanoparticles: Aggregation and phase behavior of pyrene and amphotericin B molecules in nanoparticle cores. Small. 6 (24), 2907-2914 (2010).
  40. Budijono, S. J., et al. Synthesis of stable block-copolymer-protected NaYF4:Yb3+, Er3+up-converting phosphor nanoparticles. Chemistry of Materials. 22 (2), 311-318 (2010).
  41. Chen, T., et al. Protected peptide nanoparticles: Experiments and brownian dynamics simulations of the energetics of assembly. Nano Letters. 9 (6), 2218-2222 (2009).
  42. Sosa, C., et al. Soft Multifaced and Patchy Colloids by Constrained Volume Self-Assembly. Macromolecules. 49 (9), 3580-3585 (2016).
  43. Pinkerton, N. M., et al. Formation of stable nanocarriers by in situ ion pairing during block-copolymer-directed rapid precipitation. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 319-328 (2013).
  44. Lu, H. D., Rummaneethorn, P., Ristroph, K. D., Prud’homme, R. K. Hydrophobic Ion Pairing of Peptide Antibiotics for Processing into Controlled Release Nanocarrier Formulations. Molecular Pharmaceutics. 15 (1), 216-225 (2018).
  45. Lu, H. D., et al. Encapsulation of OZ439 into Nanoparticles for Supersaturated Drug Release in Oral Malaria Therapy. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 970-979 (2018).
  46. Ansell, S. M., et al. Modulating the Therapeutic Activity of Nanoparticle Delivered Paclitaxel by Manipulating the Hydrophobicity of Prodrug Conjugates. Journal of Medicinal Chemistry. 51 (11), 3288-3296 (2008).
  47. Gindy, M. E., et al. Mechanism of macromolecular structure evolution in self-assembled lipid nanoparticles for siRNA delivery. Langmuir. 30 (16), 4613-4622 (2014).
  48. D’Addio, S. M., et al. Optimization of cell receptor-specific targeting through multivalent surface decoration of polymeric nanocarriers. Journal of Controlled Release. 168 (1), 41-49 (2013).
  49. . . Perry’s Chemical Engineers’ Handbook. , 19-20 (2007).
  50. Torrice, M. Does nanomedicine have a delivery problem?. ACS Central Science. 2 (7), 434-437 (2016).
  51. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).

Tags

Flash NanoprecipitationIFNPInverse Flash NanoprecipitationPolymeric NanoparticlesHydrophobic CompoundsHydrophilic CompoundsCIJ MixerSyringe PumpsAnti-solventQuench BathVitamin EBlock Copolymer Stabilizer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud’homme, R. K. Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles. J. Vis. Exp. (143), e58757, doi:10.3791/58757 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image