Listeria monocytogenes Infezione del cervello
Summary
Durante l’infezione, la Listeria monocytogenes è in grado di attraversare la barriera ematomeningea per colonizzare il cervello. In questo protocollo, dimostriamo come valutare la colonizzazione batterica degli organi a seguito di infezione dei topi. È disponibile una procedura per eseguire perfusione d’organo intero per determinazione specifica di numeri batterici nel parenchima del cervello.
Abstract
Listeria monocytogenes è un agente patogeno batterico intracellulare che è frequentemente associato con l’infezione di origine alimentare. La capacità di L. monocytogenes di attraversare la barriera sangue – encefalica (BBB) è relativa come può portare a pericolose meningite ed encefalite. Il BBB protegge il microambiente di cervello da vari metaboliti tossici e agenti patogeni microbici trovati nel sangue dopo l’infezione e pertanto supporta l’omeostasi del cervello. I meccanismi da cui L. monocytogenes presente nel sangue attraversare la BBB per causare cervello infezioni completamente non sono capite e c’è anche una mancanza di un sistema robusto modello per studiare le infezioni del cervello da L. monocytogenes. Qui, presentiamo un modello di infezione mouse semplice per determinare se i batteri hanno attraversato la barriera emato-encefalica e per quantificare l’onere di batteri che hanno colonizzato il cervello in vivo. In questo metodo, gli animali sono stati infettati per via endovenosa con L. monocytogenes e umanamente sono stati eutanasizzati tramite l’esposizione al CO2 seguita da dislocazione cervicale. Aspersione cardiaca degli animali è stato effettuato prima della raccolta di organi infetti. Il sangue è stato raccolto prima di aspersione e il numero di batteri per organo o mL di sangue è stata determinata mediante diluizioni degli omogeneati su piastre di agar sangue e di organi di placcatura e contando il numero di colonie formate. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le interazioni recettore-ligando romanzo che migliorano l’infezione del cervello da L. monocytogenes e possono essere facilmente adattato per lo studio di più agenti patogeni batterici.
Introduction
Il batterio gram-positivo Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare facoltativo e uno del maggior parte dei patogeni di origine alimentare mortale in tutto il mondo. Ingestione di cibo di L. monocytogenes contaminato può condurre alla listeriosi nell’uomo, una grave malattia invasiva mira principalmente gestanti, neonati, anziani che immunocompromised individui1. L. monocytogenes è tra le principali cause di morte da un agente patogeno alimentare negli Stati Uniti e case fatalità tariffe da listeriosi sono alte come 20 – 30%, il più alto per tutti i patogeni di origine alimentare2. Nessun vaccino attualmente esiste per L. monocytogenes e la capacità dei batteri di diffondere efficacemente a organi distali e il cervello attraversando l’emato – encefalica (BBB) può portare a pericolose meningite e colonizzazione del cervello3 , 4 , 5 , 6. la meningite batterica è in genere grave; mentre la maggior parte delle persone che ricevono il trattamento recuperano, infezioni possono causare gravi complicazioni, ad esempio, danni cerebrali, perdita dell’udito o difficoltà di apprendimento nei bambini. L. monocytogenes è preveduta per tenere conto di almeno il 10% di tutte le comunità acquisita meningite in US7.
Un itinerario importante per diffusione batterica al cervello e meningi è attraverso il flusso sanguigno. I batteri che circolano nei vasi sanguigni nel cervello sono in grado di attraversare la BBB per causare infezione del cervello. La BBB è un sistema altamente vascularized barriera che protegge il cervello da particelle estranee circolanti nel sangue. Cellule endoteliali costituiscono uno strato che riveste la superficie interna dei vasi sanguigni8,9. Oltre a L. monocytogenes, più batteri patogeni quali Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colie Haemophilus influenzae di tipo b (Hib) sono in grado di colonizzare il cervello di attraversare la BBB3,4,5,6. Tuttavia, quando si esaminano gli oneri batterici nel cervello dei topi infettati, è importante determinare che se i batteri hanno attraversato la BBB, altrimenti la carica batterica nel cervello può rappresentare i batteri che sono ancora nei vasi sanguigni del cervello. Pertanto, è necessario di irrorare i topi di tutto il sangue prima di determinare le unità formanti colonie (CFU) degli omogeneati del cervello.
In questo studio, descriviamo i metodi in vivo per esaminare L. monocytogenes infezione del cervello. Per i metodi descritti qui, abbiamo utilizzato il ceppo di L. monocytogenes 10403S. L. monocytogenes 10403S è uno dei ceppi di laboratorio più ampiamente usati per studiare la listeriosi sistemica nel modello murino di infezione10. Questo protocollo è basato su standard iniezione endovenosa di L. monocytogenes seguita da aspersione dei topi. Una struttura schematica del protocollo infezione nei topi è illustrata nella Figura 1. L. monocytogenes-infetti cervello e altri organi da topi non perfusi o perfusi sono stati raccolti e l’onere di organo batterica determinato. Questi metodi sono utili per determinare non solo la totale colonizzazione batterica del cervello in animali infettati, ma sono anche utili per determinare se i batteri hanno penetrato il BBB in vivo per mediare l’invasione del cervello. È importante sottolineare che questo protocollo di laboratorio dovrebbe essere condotta a seguito della consultazione con rilevanti biosicurezza istituzionali Comitato e animal facility management.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes è in grado di causare meningoencefalite pericolosa in esseri umani. Studi precedenti hanno dimostrato la capacità dei batteri di attraversare la barriera emato-encefalica (BBB) e di colonizzare il cervello. Tre percorsi dell’invasione del cervello sono stati proposti durante l’infezione: diretta penetrazione della BBB da batteri, trasporto stealth da batteri contenuti all’interno di cellule mononucleari3e migrazione assonale da ceppi di L. monocytogenes che cau…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da U.S. Public Health Service concedere AI103806 dal National Institutes of Health.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
Referencias
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
