Coloração imuno-histoquímica fluorescente multiplexada, imagem e análise de amostras histológicas de linfoma
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para multiplex immunohistochemical fluorescente de coloração e de imagem para localização simultânea de múltiplos antígenos associada a câncer de linfoma. Este protocolo pode ser estendido para a análise de colocalization de biomarcadores dentro de todas as secções de tecido.
Abstract
Métodos de imuno-histoquímica (IHC) para a análise in situ da expressão da proteína por microscopia de luz são uma ferramenta poderosa para fins de diagnóstico e pesquisa. No entanto, a visualização e a quantificação de vários antígenos em uma seção de tecido único usando IHC cromogênico convencional é um desafio. Imagem multiplexada é especialmente relevante na investigação de linfoma e diagnósticos, onde marcadores tem que ser interpretada no contexto de um microambiente do tumor complexo. Aqui descrevemos um protocolo para multiplexado IHC fluorescente coloração para permitir a avaliação quantitativa de alvos múltiplos em tipos de células específicas de interesse do linfoma. O método abrange os aspectos de validação de anticorpo, otimização de anticorpo, a otimização multiplex com marcadores de subtipos de linfoma, a coloração de lâminas de tecido microarray (TMA) e a digitalização de slides, seguido de análise de dados, com específicas referência para o linfoma. Usando esse método, partituras para ambos a intensidade média de um marcador de interesse e a percentagem de positividade são geradas para facilitar ainda mais a análise quantitativa. Multiplexação minimiza a utilização da amostra e fornece informação espacial para cada marcador de interesse.
Introduction
Neoplasias linfoides são causadas pela proliferação descontrolada de linfócitos maligna. Estas células são componentes vitais do sistema imunológico e localizar nos órgãos imunes primárias e secundárias, tais como a medula óssea, linfonodos, baço e outro sistema linfoide associado a mucosa. Neoplasias linfoides são um grupo heterogêneo de desordens que são classificados com base em uma constelação de características, incluindo morfologia, imunofenótipo, apresentação clínica e características genéticas. Enquanto cada parâmetro desempenha um papel, linhagem continua a ser uma característica definidora e constitui a base para o sistema de classificação do WHO que reconhece neoplasias derivadas de células B, células T e natural killer (NK) células1.
Chave para a classificação de linfoma foi a caracterização dos anticorpos contra marcadores de superfície dos leucócitos dos vários subtipos de linfócitos2. Imuno-histoquímica (IHC) tem sido tradicionalmente utilizado para a análise de tais marcadores e baseia-se no princípio do reconhecimento do antígeno-anticorpo específico para detectar moléculas baseadas em células e tecidos que podem ser visualizadas através do microscópio de luz 3. no entanto, a identificação de alvos múltiplos em um único slide por convencional brilhante-campo cromogênico multiplex IHC tem limitações porque muitas vezes é difícil distinguir vários sinais de cor em uma seção de tecido único confiável — especialmente para os antígenos com uma expressão muito baixo4. Avaliação visual e quantificação de coloração também podem ser subjetivas, causando a variabilidade na interpretação de dados e análise5.
Portanto, IHC convencional em amostras de formalin-fixas, parafina (FFPE) não é viável para a detecção simultânea de múltiplos alvos em imunologicamente diversas doenças como o linfoma. Além disso, distinguir linfócitos neoplásicos das células imunes circundantes é muitas vezes imprecisa. Isto dificulta estudos olhando a relevância de novos biomarcadores em linfoma. Neste contexto, IHC fluorescente multiplex (mf-IHC) oferece uma alternativa promissora como permite a avaliação quantitativa coexpression antígeno e uma relação espacial com maior precisão, preservando a limitada amostras6,7. Quando esta tecnologia de imagem é uma parceria com o software de análise de imagem digital, a interpretação dos dados é feita mais eficiente e facilita o estudo de tumor e microambiente heterogeneidade8,9. Neste protocolo, a imunofluorescência baseada em tyramide (IF) multiplexação método é aplicada para amplificar o sinal e é compatível com qualquer anticorpo IHC validados de qualquer espécie de hospedeiro, mesmo aqueles desenvolvidos na mesma espécie5,7 , 10. o protocolo baseado em tyramide permite a conjugação direta do fluoróforo no tecido de interesse para que o anticorpo primário e secundário pode ser desnudado após cada etapa, permitindo a aplicação sequencial de múltiplas manchas sem reactividade cruzada do anticorpo.
Uma estratégia multiplexada será útil para prever resultados de prognóstico e tratamento através da identificação de alvos e seus padrões variante imunológicas em linfomas. Multiplex fluorescente IHC tem sido aplicado em nosso laboratório para o estudo de um painel de marcadores de T e de linfócitos B e T-folicular marcadores de auxiliar em angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), um subtipo de um linfoma de células T periférico caracterizada por agressivo clínico comportamento e tumor heterogeneidade11. A utilidade desse método é também ilustrada em difusa linfoma de células B grande (DLBCL), onde o aumento de sinalização de um receptor de células B com expressão de C-MYC e BCL-2 simultânea sugere o uso terapêutico potencial de inibição de quinase de tirosina de Bruton 12 .
Aqui descrevemos o protocolo inteiro da validação de anticorpo para a seleção dos tecidos de controle apropriado e multiplexação usando linfoma FFPE tecidos, com uma eventual análise das lâminas coradas usando uma varredura automatizada de imagem patologia quantitativa sistema.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC tem o potencial para permitir que os patologistas para refinar diagnosticcriteria em patologia linfoide e analisar o papel dos biomarcadores em tipos de células específicas em direção a uma previsão de resultados clínicos. Como um novo método de investigação, mf-IHC é cada vez mais aplicado à identificação de vários parâmetros imunes de células de tumor17quantitativa e espacial. A detecção de mf-IHC para a expressão co de biomarcadores de tumor mostrou ser confiável e re…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.-B.N. e A.D.J. são suportados pelo Medical Research Conselho transição prêmios do Ministério da saúde a Singapore nacionais (NMRC/TA/0020/2013 e NMRC/TA/0052/2016). Os autores reconhecem uma bolsa de investigação de Yoon Siew Yong para A.D.J. partir da Universidade Nacional Cancer Institute de Cingapura para a compra de um microscópio de imagem espectral de Vectra. Este estudo é aprovado pela B Singapore NHG domínio específico Review Board (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
Referencias
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