Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro
Summary
O objetivo deste protocolo é isolar os queratinócitos epidérmicos da pele dorsal de camundongos adultos para uma variedade de aplicações a jusante, como biologia molecular, bioquímica, triagem de células ativadas por fluorescência e usos primários in vitro (por exemplo, clonogênicos queratinócitos).
Abstract
O protocolo descrito aqui é um método confiável de colheita de queratinócitos primários de camundongos fêmeas adultas (54 ± 2 dias de idade) produzindo aproximadamente 30 x 106 células viáveis por rato. Os queratinócitos adultos preliminares do rato são colhidos da pele dorsal de ratos fêmeas. Camundongos machos (~ 6 semanas de idade) podem ser usados para a colheita de queratinócitos, dependendo dos requisitos do experimento. Camundongos eutanizados são raspados e esterilizados com lavas seriadas em soluções de iodo e etanol de povidona (70% de álcool). Após a desinfecção dos camundongos, a pele dorsal é removida e a gordura subcutânea e o músculo são removidos com um bisturi e descartados. As peles são cortadas em pedaços pequenos e tratadas com uma leve, baixa temperatura tripsinização para separar a derme inferior da epiderme. As epidermes raspadas são mexido em baixa velocidade, filtrado para remover os pêlos, contados, e re-suspenso em meio de cultura. Este método fornece uma suspensão de célula única excelente de células altamente cultiváveis para muitos aplicativos downstream.
Introduction
A pele de mamíferos abrange todo o corpo e serve uma infinidade de funções (por exemplo, uma barreira física primária, regulação da temperatura e retenção de umidade). Nas últimas cinco décadas, a pesquisa básica sobre a pele do rato rendeu novas informações sobre a estrutura e a função da pele. O modelo da pele do rato ajudou extremamente a compreensão da biologia básica atrás dos mecanismos moleculars complexos da carcinogénese radiação-induzida química ou ultravioleta. Estes modelos da pele do rato forneceram uma contribuição significativa para a compreensão de doenças de pele humanas e de sua mitigação. Para explorar a dissecção molecular mais adicional dos queratinócitos preliminares na biologia desenvolvente do folículo de cabelo, na pesquisa da pilha de haste, na carcinogénese, e na exploração genética da epiderme, é freqüentemente desejável isolar e a cultura epithelial preliminar queratinócitos da pele dos ratos a usar-se paralelamente com experimentos in vivo. O fator motivador no desenvolvimento deste método foi a necessidade de um ensaio in vitro para células-tronco epidérmicas e folículo-pilosos clonogênicos1,2. Havia também uma necessidade urgente para suspensões da única pilha de pilhas epidérmicas apropriadas para os ensaios ensaios3, a classificação de pilha ativada fluorescência, e o fluxo citometria3,4. As vantagens deste método são uma colheita robusta aumentar uma ordem de magnitude sobre outros métodos5,6, inclusãoda porção epitelial dos folículos pilosos, e a alta culturabilidade das células colhidas. Na década de 1980, não havia métodos conhecidos que pudessem atender a esses requisitos. Nos anos subsequentes, este método foi refinado para aumentar o rendimento celular. A principal limitação desse método seria mascarar alguns anticorpos sensíveis à tripsina que comprometeriam a imunoreatividade6.
Os camundongos receberam o pecuária de acordo com as directrizes específicas do micróbio patogénico livre. Foram obtidos um a cinco camundongos fêmeas 54 ± 2 dias de idade. Em camundongos mais velhos, a viabilidade dos queratinócitos será reduzida devido à fase anágena (crescimento) do ciclo capilar. Além disso, o processo de tripsinização é mais difícil em comparação com camundongos jovens. O procedimento de colheita foi otimizado com sucesso para a pele mais fina de camundongos fêmeas em comparação com o sexo masculino. Os ratos masculinos geralmente não são usados para colheitas do queratinócito porque têm uma tendência lutar um com o outro durante a carcaça e conseqüentemente podem deixar riscos ou feridas na pele.
Protocol
Todos os protocolos de uso de animais vertebrados foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Minnesota, de acordo com as diretrizes recomendadas da NIH e do governo. 1. inicialização e Subculturing da camada do alimentador Descongelar um frasco de células contendo o rato suíço congelado 3T3 do reservatório de azoto líquido colocando o frasco num banho de água de 37 ° c durante 1-2 min. O número de células no frasco para injetáveis é de aproximadamente 1 x 106. Retire o frasco para injetáveis de células 3T3 quando o fragmento final de gelo tiver derretido. Limpe o tubo com um cotonete de álcool de 70%. Em seguida, transfira o frasco para injetáveis para um gabinete de biossegurança. Transfira as células lentamente para um balão T-150 e enxague o frasco para injetáveis 3T3 com 1 mL de meio CGM. Adicione lentamente 30 mL de meio de crescimento completo de 3T3 pré-aquecido (CGM) às células. Agitar suavemente o balão para espalhar uniformemente as células de fibroblastos 3T3. Rotule o balão com detalhes da linha celular, data e número de passagem apropriadamente. Incubar as células a 37 ° c com 5% de CO2 e 95% de humidade.Nota: De acordo com o ATCC, o tempo de duplicação do rato suíço 3T3 é 18 h; Quando confluente (contato inibido), a densidade é de cerca de 40.000 células por cm2. Nós usamos uma linha particular de 3T3 dentro de 10-15 passagens após a inicialização. Um crescimento mais rápido ou a presença de células em forma de fuso pode ocorrer em passagens mais elevadas e é geralmente um sinal de que o 3T3 não irá executar, bem como células de alimentação para keratinócitos adultos do rato. Se o crescimento rápido ocorre, é melhor iniciar uma nova linha de células de passagem inferiores. Mude a mídia após 24 h para remover as células mortas e o DMSO remanescente (agente de criopreservação) e duas vezes por semana. Permita que as células proliferem em torno de 80% de confluência e use frascos T-150 para iniciação da cultura. Use frascos T-225 para subcultura após a inicialização. Para subcultura 3T3 células fibroblastos, retire o balão da incubadora da cultura celular e lave duas vezes com PBS estéril frio (1x) com gentamicina. Pipet 10 mL de solução de tripsina pré-aquecida (banho de água 37 ° c) (0,25%) em cada balão T-225. Coloque o balão sobre uma placa de aquecimento durante 3-8 min. Retire o balão e use suavemente as palmas das mãos para tocar nas paredes do balão para separar as células e confirmar o descolamento da célula microscópio invertido. A solução de tripsina pode parecer turva com células 3T3 separadas. Pipet a solução de tripsina 3 – 4x para lavar a superfície de crescimento celular do balão e transferir a célula tripsinizadas para 30 ml de CGM em um tubo cônico de 50 ml. Relave o balão 3 – 5x com 10 mL da mistura CGM-Trypsin-Cell a partir do tubo cônico de 50 mL.Nota: O conteúdo de dois conteúdos de balão pode ser adicionado a um tubo de 50 mL; se apenas um frasco for utilizado, coloque 10 mL de tripsina/células em 20 mL de CGM num tubo de 50 mL. Centrifugue o tubo cônico de 50 mL a 160 x g durante 7 min a 4 ° c. Agora aspirar o sobrenadante e ressuscitar a pelota da pilha com 5 mL de CGM, pipetando suavemente ~ 10x para interromper completamente a pelota da pilha. Adicionar 10 mL de CGM para trazer o volume total do tubo cônico 50 mL para 15 mL. Misture novamente ~ 10x e coloque 5 mL da suspensão celular em 3 frascos T-150 separados. A relação da subcultura é 1:3 em frascos T-225 ou em 1:4 em frascos T-150. Adicione 30 mL de CGM pré-aquecido 3T3 a cada uma das garrafas. Rotule o balão com o nome da linha da célula, a data da propagação da célula e o número da passagem. Para congelar para baixo 3T3 pilhas depois da centrifugação na etapa da subcultura, remova o tubo 50 mL da centrífuga e coloc em uma cubeta de gelo. Aspirar o sobrenadante e ressuscite o pellet de células com 1 mL de mistura DMSO-DMEM de 5% (ver tabela 1) para cada frasco colhido. Coloque 1 mL de mistura de DMSO-DMEM com suspensão celular em cada critfrasco (um criocelular por frasco de 3T3 colhido). Rotule o frasco com o número de passagem, o nome da linha celular (3T3) e a data em que as células foram congeladas. Coloque estes frascos de célula 3T3 no frasco do congelador da pilha (veja a tabela de materiais) e transfira-o ao congelador de-70 ° c para > 5 h. Retire e transfira cuidadosamente os frascos do frasco do congelador da pilha e coloque-o num reservatório de armazenamento de azoto líquido para armazenamento a longo prazo até ao próximo uso . Insira informações sobre o nome da linha da célula, o local no tanque e a data na folha de inventário de nitrogênio líquido do laboratório. 2. preparação da camada do alimentador 3T3 para a irradiação e a semeadura do raio X Prepare 3T3 células uma semana antes de sua irradiação e permitir-lhes crescer ~ 100% confluência. As células 3T3 são tipicamente dentro das passagens de 120 a 130. Para os ensaios clonogénicos bem sucedidos de keratinocytes preliminares, antes de semear 3T3 pilhas, revestimento de superfície os 60 pratos de Petri do milímetro com um colagénio. Pipet em torno de 2 – 3 mL da solução de revestimento de colágeno em 60 mm pratos de Petri para revestir a superfície inferior e remover o excesso de colágeno-revestimento líquido (ver tabela 1). Transfira as placas de Petri para uma incubadora de 37 ° c com 5% de CO2 para um mínimo de 1 h. Não deixe os pratos secos na incubadora. Passo de irradiação de raios-X: siga os passos 1.4 – 1.6. Use 50 mL de CGM fresco para re-suspender o pellet celular, fechar o tubo cônico e vedação com película de vedação de parafina. Para evitar qualquer contaminação, use sacos de plástico para dobrar o saco de parafina-selado célula contendo tubo e coloque no gelo. Uma camada alternativa baseada do alimentador da mitomicina pode ser usada para A cultura7do queratinócito. Irradie células de fibroblastos 3T3 no tubo cônico 50 mL com uma dose de 5.000 rads (50 Cgy) com uma máquina biológica de raios-x. Irradiar essas células junto com a mídia CGM. Após a irradiação do raio X, as pilhas do centrifugador em 160 X g para 7 min em 4 ° c. Aspirar a mídia sobrenadante e gentilmente ressuscite pellet celular com 5 mL de CGM triturando suavemente ~ 10x. Agora, traga o volume final para 30 mL com 25 mL adicionais de meio e triturar 10x. Estas etapas triturando são cruciais para a camada 3T3 uniforme do fibroblasto para o ensaio do clonogenicidade. Contagem de células viáveis: Conte os queratinócitos usando um hemociômetro de vidro regular. Tome aproximadamente 0,5 mL das células e coloque-o num tubo de 1,5 mL. Remover 200 μL de mistura celular e adicionar um volume igual de 0,4% trypan solução azul e mistura 3 – 4x. Transfira células com um hemociômetro e conte todas as células nucleadas (pequenas células de ouro e rosa) como células viáveis. Calcule a concentração final de células de ouro viáveis. Pipetar 1 x 106 3T3 células (um mínimo de 7 x 105) células podem ser usados) em 60 mm colágeno revestido de placas de Petri (passo 2,2) e adicione suavemente 4 ml de alta de cálcio modificado Williams e meios de comunicação (ver tabela 1). Permitir recém-semeadas 3T3 células para anexar para 24 h. No dia seguinte, colher o queratinócito primário fresco e semente-los em cima da camada de fibroblastos 3T3 anexado para ensaio clonogênico como indicado abaixo. 3. colheita e semeadura primária de queratinócitos Eutanizar quatro a cinco ratos fêmeas adultas através da inalação de CO2 de acordo com padrões aprovados da facilidade animal/IACUC. Entretanto, este protocolo pode igualmente ser usado para únicos ratos fêmeas/masculinos. Clip aproximadamente 9 cm2 da pele dorsal com uma tosquiadeira animal elétrica e coloque todos os ratos cortados em um frasco de 500 ml com solução anti-séptico de iodo povidona suficiente (não esfregue) para cobri-los por 1 – 2 min. agitar bem o frasco para revestir uniformemente o anti-séptico solução sobre os ratos. Despeje a solução e enxague com água limpa até que o líquido corra bem. Repita a mesma lavagem anti-séptico seguida por uma enxaguadura de água. Após a lavagem anti-séptico com solução de iodo, mergulhe todos os camundongos em 70% de etanol por 5 – 10 min.Nota: Camundongos com pêlo leve (por exemplo, BALB/c) manterá uma ligeira cor amarelada das lavas de iodo anti-séptico, enquanto os camundongos mais escuros (por exemplo, C57BL/6) não. Notavelmente, a viabilidade celular ou o crescimento da cultura não é afetado devido à cor amarela. Remova com cuidado a pele dorsal cortada usando o fórceps do polegar e as tesouras em uma capa do fluxo laminar. Coloc a pele dorsal extirpada no tubo cônico enchido com o Gentamycin de PBS/2x. Evite usar a pele lateral ventral para impedir a contaminação mamária da pilha na cultura. Usando o fórceps autoclavado e um bisturi, coloc uma pele dorsal em um lado peludo do tempo para baixo em um prato de Petri fino. Comece raspando todo o tecido subcutaneous que inclui a gordura do lado ventral do tecido da pele até que esteja semi-translúcido. Tente remover os traços máximos de tecido subcutâneo sem rasgar a pele (parte do folículo piloso). Além disso, não raspar por um longo tempo e evitar a secagem da pele. Mantenha a pele raspada na solução PBS até que todas as outras peles restantes sejam processadas. Usando um bisturi, fatias de peles em 0,5 cm x 1-1.5 cm tiras e coloque o lado peludo para cima em uma placa de Petri estéril. Cuidadosamente pipeta 20 mL de solução de gentamicina PBS/2x misturada com tripsina (0,25%) em um prato de Petri plástico de 100 milímetros x de 20 milímetros. Usando fórceps estéril, transfira as peles e flutue-os lado peludo acima na superfície da solução do tripsina para 2 h em uma incubadora de 32 ° c.Nota: o tempo e a temperatura de trypsinization são cruciais para o bom rendimento de keratinocytes preliminares altamente cultiváveis. Embora outros métodos possam fornecer bons rendimentos de células viáveis, a culturabilidade dos queratinócitos tem sido menos satisfatória. Durante este tempo de incubação de 2 h, cubra os pratos com revestimento de colagénio e coloque-os a 37 ° c durante 1 h (ver passo 3.1.2). Para ensaios clonogênicos, as placas de Petri de 60 mm já foram revestidas 24 h antes da colheita de queratinócitos para permitir que a camada de alimentador 3T3 irradiada se encaixe na parte inferior e se espalhe uniformemente.Nota: O revestimento de pratos da cultura para a cultura ensaios é muito importante para o acessório apropriado, a formação da colônia, e o crescimento/proliferação finais de keratinocytes epidérmicos dos ratos. Passo de raspagem epidérmica: organize um prato de Petri quadrado de plástico estéril e crie uma superfície a uma inclinação de 30 ° para a raspagem epidérmica adequada com 15 mL de meio de colheita (ver tabela 1). Retire cuidadosamente uma tira de pele flutuante da solução de tripsina com fórceps curvo. Com uma nova lâmina de bisturi, raspe a epiderme e os pêlos no meio. Não use força excessiva, mas use força suficiente para raspar a epiderme, ou isso afetará a viabilidade celular. Durante a raspagem da epiderme, mantenha a lâmina perpendicular à parte da pele. Se a lâmina está inclinada para o movimento da lâmina, há mais chances de rasgar a pele. Se a lâmina estiver inclinada para longe do movimento da lâmina, há mais chances de remoção insuficiente da epiderme. Despeje cuidadosamente o meio de colheita contendo células epidérmicas raspadas em um frasco estéril de 60 mL (autoclavável e reutilizável) com uma barra de agitação magnética de 1,5 polegadas. Enxágüe a placa de Petri com meio de colheita adicional para coletar células epidérmicas remanescentes e trazer o volume final para 30 mL. Use um agitador magnético e mexa em 100 RPM por 20 min à temperatura ambiente. Este processo removerá as pilhas epidérmicas prendidas dos cabelos. Coloque um filtro de célula estéril de 70 μm na parte superior de um tubo cônico de 50 mL. O filtro da pilha cabe em cima de um tubo cônico de 50 mL. Pegue o jarro dentro de um capuz de biossegurança. Retire a barra de agitação e despeje o conteúdo no filtro de peneira anexado a um tubo cônico de 50 mL. Esticar o cabelo indesejado e folhas de estrato córneo. Pressione os cabelos junto com materiais do córneo do estrato dentro do filtro e manipule-os para liberar as pilhas de cabelo prendidas. Use 5 mL de meio de colheita para permitir que as células presas restantes sejam liberadas e fluam no tubo. Traga o volume total até 50 mL no tubo cônico. Tampe o tubo cônico 50 mL com filtrado de células e centrifugador a 160 x g durante 7 min a 4 ° c. Em seguida aspirar o sobrenadante e adicionar 5 mL de meio de colheita. Resuspend a pelota da pilha triturando delicadamente ~ 20x com um Pipet de 5 mL. Nesta etapa, mantenha as células em uma caixa de gelo para evitar qualquer agregação. Adicionar 25 mL de meio de colheita e triturar novamente (20 – 25x). Para garantir uma contagem exata de queratinócitos nesta etapa, tome 1 mL de suspensão celular e adicione um meio de colheita de 19 mL. Agora a diluição celular é 1:20 em 50 mL tubo cônico. Se os queratinócitos forem colhidos de um único rato, ajuste o volume da suspensão da célula. Em vez de 30 mL, use 15 mL e faça uma diluição 1:10 para a contagem das células. Pipet 0,5 mL de células diluídas do tubo cônico 50 mL (1:20 diluição) e transferência para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL autoclavado. Remova 0,2 mL (200 μL) de mistura de células para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione um volume igual (200 μL) de solução de azul de trypan de 0,4%. Misture suavemente esta solução 3x e transfira células para um hemociômetro para contagem de queratinócitos nucleados. Marcar todas as células azuis escuras positivas para o azul de trypan como células mortas não viáveis, e marcar pequenas células de ouro e rosado como células viáveis. O rendimento final de queratinócitos por rato deve ser de cerca de 30 milhões células viáveis. Centrifugue o tubo cônico 50 mL original (do passo 3,8) durante 7 min a 160 x g a 4 ° c. Nesta etapa, Ressuspender as células no meio desejado e fazer a diluição necessária para as células de semeadura. Para a cultura de massa, semente 2 a 4 milhões células de ouro viáveis em cada prato de Petri de 35 mm em meio de cultura celular (KGM-tipo médio + suplementos para culturas monocamada) (ver tabela 1). Para um ensaio clonogénico (formação de colónias), sementes 1.000 células por 60 mm prato de Petri em X-Ray irradiado Swiss mouse 3T3 camadas de alimentador com colágeno-revestimento e modificado William ‘ s e meio com suplementos e soro. Use um total de 2 a 4 mL de meio para 35 mm e 60 mm pratos de Petri, respectivamente. Além disso, formular DMEM e Williams E médio adquiridos a partir de ATCC com níveis reduzidos de bicarbonato de sódio para uso em 5% CO2. Cresça as células de cultura (massa ou clonogénicas) a 32 ° c, 95% de humidade com 5% de CO2. Mude os meios um dia após a semeadura inicial para a cultura maciça, e então 3x semanalmente depois disso. No entanto, para os ensaios clonais, a primeira mudança média é de 2 dias após a semeadura celular e 3x semanalmente depois. Para cultura clonal, cultivar células em intervalos de duas e quatro semanas. Após a conclusão das culturas clonais (2 ou 4 semanas), aspirar o meio. Fixar as colônias em 10% de formalina tamponada durante a noite em temperatura ambiente e mancha com 0,5% de rodamina B em autoclave de água para 1 h. Em seguida, retire a mancha de rodamina B com uma pipeta da borda dos pratos. Lave os pratos em água fria esterilizada até que os pratos correm claro. Põr os pratos inclinados na tampa dos pratos e deixe-os secar para a contagem final da colônia. Notavelmente, ao realizar o ensaio de cultura clonogênica, nunca Pipet < 1 mL de células. Se as células estiverem concentradas, diluir serialmente a concentração celular.
Representative Results
Tipicamente, os rendimentos de queratinócitos epidérmicos por rato variando de 20 x 106 a 30 x 106 trypan azul excluindo células são obtidos8,9. A viabilidade varia de 80%-90%. As eficiências de semeadura típicas são cerca de 30% de fixação a 24 h. a formação de colônias em camadas de alimentador 3T3 irradiadas é de cerca de 60 colónias por 1.000 células viáveis para camundongos C57BL/6 e aproximadamente 30 colônias por 1.000 células para camundongos de tipo suíço10 ,11. Os resultados típicos dos ensaios de formação de colônias são ilustrados na Figura 1. O número de células-tronco do folículo piloso é de aproximadamente 9% CD34+/Cd49f+ células-tronco para C57Bl/6 camundongos12. Os resultados típicos da citometria de fluxo são dados na Figura 2. As características de crescimento de quatro mídias diferentes são ilustradas na Figura 3. Os meios testados incluem o KGM-Gold, o SFM, o meio de William e o Morris-2 (um meio de cálcio reduzido desenvolvido no laboratório de Morris baseado em Williams E). Figura 1: exemplos representativos de um ensaio para queratinócitos clonogênicos de camundongos adultos. Esta fotografia demonstra a formação da colônia do queratinócito dos ratos fêmeas CD-1 54 dias da idade tratou topicamente com 1) nenhum tratamento, 2) o acetona seguiu uma semana mais tarde pela acetona duas vezes por semana por duas semanas, 3) DMBA seguiu uma semana mais tarde pela acetona duas vezes por semana por duas semanas, 4) a acetona seguiu uma semana mais tarde por TPA duas vezes por semana por duas semanas, e 5) DMBA seguiu uma semana mais tarde por TPA duas vezes semanalmente por duas semanas. Após os tratamentos in vivo, os queratinócitos foram colhidos e semeados em 1.000 células por prato em camadas dosadoras de 3T3 irradiadas e cultivadas por duas semanas, após as quais os pratos foram fixados com formalina tamponada e corados com rodamina B. Os pratos em cada coluna são replicações de cada grupo de tratamento de mouse. Note-se que o número de colônias maiores aumentou após o tratamento com DMBA, e o número total de colônias aumentou o tratamento de TPA dos camundongos antes da colheita de queratinócitos. Abreviaturas: DMBA: 7, 12-dimethylbenz [a] antraceno; TPA: 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: exemplo representativo de citometria de fluxo de células-tronco do folículo piloso de camundongos adultos. Momentaneamente, os queratinócitos preliminares isolados foram isolados da pele dorsal dos ratos e filtrados para restos celulares usando o filtro da pilha. A suspensão isolada do queratinócito foi etiquetada com anticorpos de CD49f ou de α6-integrin (PE) e de CD34 (FITC) junto com a tintura inoperante viva e os outros controles. Os anticorpos de controle do isotipo FITC e PE (Rat IgG2akappa) foram utilizados para fins de compensação (ver tabela de materiais). As pilhas de haste foram selecionadas por meio de CD49f (canaleta do PE), que reconheceu o componente externo dos hemi-desmosomes encontrados em pilhas epidérmicas e do folículo de cabelo básicos, e CD34 (canaleta de FITC), que reconheceu as pilhas de haste do folículo de cabelo (isto é, CD34-FITC+ e A6-PE+ (coluna superior direita, total 5%)). A coluna do lado direito mostra as populações diferentes do queratinócito a saber CD34-FITC somente, pilhas de CD34-FITC e de a6-PE (população positiva dobro da pilha de haste), A6-PE somente, e pilhas unmanchado. Note-se que existem duas populações de células-tronco CD34+ como foram relatadas6,14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: comparação de quatro mídias diferentes em culturas primárias de células epidérmicas de camundongos fêmeas adultas. Os queratinócitos primários foram isolados da pele dos camundongos dorsais e contados para semeadura utilizando quatro diferentes meios de comunicação (KGM, SFM, Willem ‘ s-e e Morris-2). O número igual de queratinócitos foi semeado e seguido para sua morfologia geral e teste padrão de crescimento. Note-se que os queratinócitos proliferating têm morfologias ligeiramente diferentes. KGM, SFM, e Morris-2 todos os quais são os meios de cálcio reduzidos têm o crescimento mais robusto após quatorze dias. Em contraste, as células não persistem quando cultivadas em meio Williams E que tem 1,4 mM de cálcio e uma alta proporção de potássio para sódio. Surpreendentemente, o meio de Williams e com suplementos e vinte por cento de soro bovino fetal suporta culturas clonais de queratinócitos muito melhor do que qualquer outro meio testado, provavelmente porque o meio de Williams E enriquecido ajuda as células de alimentador 3T3 para “alimentar” melhor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Soluções e mídia Comentários Soluções de colheita 2,5% tripsina (5 mL) PBS de Dulbecco (500 mL) Gentamycin (2 mL) PBS com Gentamycin 2x (45 mL) Soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) com 2x gentamicina Solução de tripsina Soluções de cultura de células Purecol-solução de revestimento de prato de fibronectina: 1 M de HEPES (1 mL) 116 mM CaCl2 (1 mL) Albumina sérica bovina 1,0 mg/mL (10 mL) Meio de cultura celular (100 mL) Fibronectina (1 mg) Colágeno purecol (1 mL) Solução de congelamento de células DMSO (2 mL) DMEM com 10% BCS e Pen-Strep Meio de colheita Precisa ser sem cálcio 2x Gentamycin (1 mL) FBS (50 mL) SMEM (500 mL) Alta-cálcio Williams ‘ E Media com: EGF (5 μg/mL) 1 mL Glutamina 14,5 mL Hidrocortisona (1 mg/mL) 0,5 mL Insulina 1 mL LinoAcid-BSA (0,1 mg/mL) 0,5 mL MEM ESS aminoácidos 4 mL MEM vitaminas 5 mL Penicilina-estreptomicina 5 mL Transferrina (5mg/mL) 1 mL Vit A (1 mg/1000 μL) 57,5 μL Vit E 1 mg/mL (4 ° c) 3,5 μL Vit D2 (10 mg/mL) 50 μL meio de crescimento completo do fibroblasto 3T3 (CGM) BCS (100 mL) DMEM (900 mL) Penicilina-estreptomicina (10 mL) KGM O meio usado para a cultura maciça é um meio de cálcio reduzido Morris 2 médio com os mesmos suplementos que Williams ‘ E Uma variante de cálcio reduzida de Williams E com suplementos Tabela 1: soluções e receitas de mídia.
Discussion
O método de colheita de queratinócitos descrito aqui foi desenvolvido para produzir altos rendimentos de queratinócitos epidérmicos primários altamente culturáveis da parte de trás de camundongos fêmeas adultas. Estes queratinócitos são adequados para citometria de fluxo, aplicação de biologia molecular e cultura de células primárias, incluindo o ensaio clonogênico relatado aqui. Este método de colheita de queratinócitos também tem sido útil para estudar outros aspectos a jusante da carcinogênese química cutânea eda promoção tumoral,13.
Existem várias etapas críticas no protocolo. Primeiramente, para rigor e reprodutibilidade, utilizaram-se camundongos fêmeas de idade de 54 ± 2 dias. Isso nos permitiu realizar ensaios de colônias sensíveis e quantitativas a partir de múltiplas cepas de camundongos e utilizá-los como um fenótipo na análise de ligação levando à identificação de pelo menos um novo gene regulador de células-tronco10,11. Em segundo lugar, é útil para cortar as peles em pedaços menores, como a tripsinização é mais eficaz do que tentar manter a pele inteira. Em terceiro lugar, o tempo e a temperatura da flotação de tripsina é muito importante para a culturabilidade subsequente. Além disso, é preciso “picar consideravelmente” os pêlos restantes no filtro para desalojar as células anexadas. Esta etapa é importante para obter altos rendimentos das células. Além disso, a temperatura de 32 ° c da incubadora é importante para o cultivo a longo prazo dos queratinócitos dos ratos adultos. Finalmente, neste protocolo, os leituras paralelos de experimentos in vitro e in vivo1 baseiam-se em culturas primárias em vez de subculturas ou linhas celulares. Notavelmente, se a colheita de queratinócitos primários pela primeira vez usando este protocolo, manter a derme remanescente após a raspagem para confirmar a remoção completa dos folículos pilosos, juntamente com a epiderme por observação histopatológica.
A força principal deste protocolo para colher queratinócitos adultos do rato é que produz rendimentos elevados de pilhas cultiváveis que são apropriadas para muitas aplicações a jusante. A limitação principal é que alguns resumos de superfície da pilha podem ser sensíveis ao tripsinização tal que a imunomarcação pode ser comprometida. Conseqüentemente, ao testar um anticorpo novo da superfície da pilha, pode ser prudente usar um Dispase6 ou um método baseado de grupo5 para a colheita para a comparação. O significado deste protocolo é que tem sido rigorosamente testado, quantificado e aplicado a tais aplicações diversas como ensaios para células estaminais clonogênicas1,9,10,11, paraculturas de massas em bioquímica8, para a triagem de FACS na análise de células-tronco3,4, paraa biologia molecular3,12, e para o sequenciamento contínuo de RNA e DNA.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores não têm agradecimentos.
Materials
| 0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
| 1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
| 10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
| 2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% Trypsin solution 10X | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
| 32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
| 35-mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
| 5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
| 60-mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
| 70% ethanol | |||
| 90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
| Cell Strainer, 70-µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Collagen, Bovine, Type I, 30mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Lonza | CC-3103 | |
| Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
| No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
| Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
| Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
| Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
| Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
| Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
| Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz | Triad Group | 10-8216 | |
| VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Ziploc bag |
Referencias
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- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
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- Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
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- Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
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- Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled. Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).
- Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
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- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).
Citar este artículo
Morris, R. J., Readio, N., Boland, K., Johnson, K., Lad, S., Singh, A., Singh, A., Holtorf, S., Skaar, S. Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture. J. Vis. Exp. (150), e58701, doi:10.3791/58701 (2019).