בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד keratinocytes עוריות מן העור העורבי של עכברים מבוגרים עבור מגוון של יישומים במורד הזרם כגון ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה, מיון תא מופעל פלואורסצנטית, ו העיקרי בשימוש בלתי מתורבת (למשל, clonogenic keratinocytes).
Abstract
הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה אמינה של קצירת keratinocytes העיקרי מעכברים נקבה בוגרים (54 ± 2 ימים) מניב כ 30 x 106 תאים קיימא לכל עכבר. העכבר הראשי מבוגרים keratinocytes נקצרו מן העור החלק של עכברים נקבה. עכברים זכרים (~ 6 שבועות בן) ניתן להשתמש עבור קצירת keratinocyte בהתאם לדרישות של הניסוי. עכברים מורדמים הם מגולח ומעוקר עם שוטף סדרתי povidone יוד והאתנול פתרונות (70% אלכוהול). לאחר חיטוי העכברים, את העור העורמת מוסר את השומן התת עורי השריר מוסרים עם אזמל ומושלך. העורות חתוכים לחתיכות קטנות ומטופלים עם טריסיזציה קלה ונמוכה כדי לנתק את הדרסטיות הנמוכות מהאפידרמיס. Epidermises מגורד מעורבב במהירות נמוכה, מסוננים כדי להסיר את השערות, נספר, ו מחדש מושעה במדיום התרבות. שיטה זו מספקת תא השעיה מעולה יחיד של תאים מאוד מסוגלים לעבור יישומים רבים במורד הזרם.
Introduction
העור מכסה את הגוף כולו ומשמש מגוון פונקציות (למשל, מכשול פיסי ראשוני, רגולציה ושימור לחות). במהלך חמשת העשורים האחרונים, מחקר בסיסי על עור העכבר הניב מידע חדש על המבנה והתפקוד של העור. מודל העור של העכבר עזר מאוד להבין את הביולוגיה הבסיסית מאחורי מנגנונים מולקולריים מורכבים של מסרטנים כימיים או אולטרה סגולה מושרה בקרינה. אלה מודלים העור העכבר סיפק תרומה משמעותית להבנת מחלות עור האדם ואת ההקלה שלהם. כדי לחקור ניתוח מולקולרי נוסף של keratinocytes העיקרי בביולוגיה התפתחותית זקיק השיער, תאי גזע מחקר, קרצינובגנזה, וחקר גנטי של האפידרמיס, הוא רצוי לעתים קרובות לבודד ותרבות האפיתל העיקרי keratinocytes מן העור עכברים להשתמש במקביל עם ניסויים vivo. הגורם מוטיבציה בפיתוח שיטה זו היה הצורך באופן מתורבת בתוך שיטת מבחנה בלתי עוריות ושיער זקיק תאי גזע1,2. היה גם צורך דחוף השעיות תא בודד של תאים עוריות מתאים לclonogenic בחני3, מיון תא מופעל פלואורסצנטית, וזרימה cy, try3,4. היתרונות של שיטה זו הם קציר חזק להגדיל את סדר הגודל על פני שיטות אחרות5,6, הכללת החלק האפיתל של זקיקי השיער, ואת היכולת הגבוהה של התאים שנקטפו. בשנות השמונים לא היו שיטות ידועות שיכולות לעמוד בדרישות הללו. בשנים הבאות, שיטה זו היה מעודן כדי להגדיל את תפוקת התאים. המגבלה העיקרית של שיטה זו תהיה מסווה של מספר טריפסין של נוגדנים רגישים שהיו מתפשרים על פעילות חיסונית6.
העכברים קיבלו טיפול בהתאם הנחיות ספציפיות הפתוגן חינם. אחד עד חמש עכברים נקבה 54 ± 2 ימים של גיל הושגו. בעכברים מבוגרים, הכדאיות של keratinocytes יופחת עקב שלב anagen (צמיחה) של מחזור השיער. כמו כן, תהליך הטריסינוניזציה קשה יותר בהשוואה לעכברים צעירים. הליך הקציר הותאם בהצלחה לעור הדליל של העכברים הנקביים בהשוואה לזכר. עכברים זכרים בדרך כלל לא משמשים ליבול keratinocyte כפי שיש להם נטייה להילחם אחד עם השני במהלך הדיור ולכן יכול להשאיר שריטות או פצעים על העור.
Protocol
כל בעלי חוליות השימוש בפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת מינסוטה על פי ההנחיות המומלצות של NIH והממשלה. 1. אתחול שכבת ממזין והרכבת המשנה הפשרת בקבוקון תא אחד המכיל שוויצרי העכבר השוויצרי 3T3 מן הטנק חנקן נוזלי על ידי הצבת הבקבוקון ב 37 בג ° c באמבט מים עבור 1-2 דקות. מספר התאים בבקבוקון הוא כ-1 x 106. הסר את בקבוקון התא 3T3 כאשר השבב הסופי של הקרח נמס. נגב את הצינור בעזרת. מ70% אלכוהול ואז, להעביר את המבחנה. לארון בטיחות העבר את התאים לאט לתוך בקבוקון T-150, ולשטוף את בקבוקון 3T3 עם 1 מ ל של מדיום CGM. לאט להוסיף 30 מ ל של טרום מחומם 3T3 בינוני גדילה (CGM) לתאים. בעדינות לנדנד את הבקבוקון כדי להפיץ באופן שווה את התאים 3T3 פיברולסט. סמן את הבקבוקון באמצעות פרטי קו התא, תאריך ומספר מעבר כראוי. מודיית את התאים ב 37 ° צ’ עם 5% CO2 ו 95% לחות.הערה: לפי ATCC, זמן ההכפלה של 3T3 עכבר שוויצרי הוא 18 h; כאשר שוטפת (מגע העכבות), הצפיפות היא כ 40,000 תאים לכל ס מ2. אנו משתמשים בקו מסוים של 3T3 בתוך 10-15 מעברים לאחר אתחול. צמיחה מהירה יותר או נוכחות של תאים בצורת ציר יכול להתרחש במעברים גבוהים והוא בדרך כלל סימן כי 3T3 לא לבצע כמו גם תאים מאכיל עבור מבוגרים עכבר keratinocytes. אם מתרחשת צמיחה מהירה, עדיף ליזום שורה חדשה מתאי מעבר נמוכים. שינוי מדיה לאחר 24 שעות כדי להסיר תאים מתים ו DMSO הנותרים (סוכן הקפאת ההזמנה), ופעמיים שבועי לאחר מכן. אפשר לתאים להתרבות סביב 80% למפגש ולהשתמש במבחנות T-150 לצורך חניכה תרבותית. השימוש T-225 מבחנות עבור תת-תרבות לאחר אתחול. כדי מתת-תרבות 3T3 פיברוהפיצוץ תאים, להסיר את הבקבוקון מן החממה תרבות התא ולשטוף פעמיים עם הקור מעוקר PBS (1x) עם בג. Pipet 10 מ ל של טרום מחומם (37 אמבט מים ° c) טריפסין פתרון (0.25%) לתוך כל T-225 בקבוקון. מניחים את הבקבוקון על צלחת מחמם עבור 3-8 דקות. הסר את הבקבוקון ובעדינות להשתמש בכפות כדי להקיש על קירות הבקבוקון לנתק תאים ולאשר ניתוק התא תחת מיקרוסקופ הפוך. פתרון טריפסין עשוי להופיע מעונן עם תאים תלת-ממדיים מנותקים. הפוך את הטריפסין לפתרון 3 – 4x כדי לשטוף את משטח צמיחת התאים של הבקבוקון ולהעביר את התאים הטריצימיזציה ל-30 מ ל של CGM בשפופרת מ50 mL. שטפי מחדש את הבקבוקון 3 – 5x עם 10 מ ל של התערובת תא CGM-טריפסין מצינור 50 mL.הערה: תוכן של שני בקבוקון ניתן להוסיף לצינור 50 mL; אם נעשה שימוש בבקבוקון אחד בלבד, לאחר מכן הנח 10 מ ל של טריפסין/תאים לתוך 20 מ ל של CGM בצינור 50 mL. צנטריפוגה את צינור 50 mL ב-160 x g עבור 7 דקות ב 4 ° c. עכשיו לאכול את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא עם 5 מ ל של CGM, ללטף בעדינות ~ 10x כדי לשבש לחלוטין את הגלולה התא. הוסף 10 מ ל של CGM להביא את הנפח הכולל של 50 mL שפופרת חרוט ל 15 mL. לערבב שוב ~ 10x ומקום 5 מ ל של השעיית התא 3 הנפרד T-150 מבחנות. היחס תת-תרבות הוא 1:3 ב T-225 מבחנות או 1:4 ב T-150 מבחנות. הוסף 30 מ ל של טרום מחומם 3T3 CGM לכל אחד מבחנות. סמן את הבקבוקון עם שם הקו הנייד, את תאריך זריעת התאים ואת מספר המעבר. כדי להקפיא את התאים 3T3 בעקבות צנטריפוגה בשלב תת-תרבות, להסיר את שפופרת 50 mL מן הצנטריפוגה ומקום על דלי קרח. משלחים את הסופרנטאנט ומקצרים את הגלולה הסלולרית עם 1 מ ל בתערובת של 5% DMSO-Dמאמ (ראו טבלה 1) עבור כל בקבוקון שנקטפו. מקום 1 mL של תערובת DMSO-DMEM עם השעיית התא לתוך כל קריובקבוקון (אחד קריומיט עבור בקבוקון 3T3 שנקטפו). סמן את המבחנה באמצעות מספר המעבר, שם קו התא (3T3) והתאריך שבו התאים קפאו. מניחים אלה מבחנות תא 3T3 לתוך צנצנת מקפיא תא (ראה טבלת חומרים) ולהעביר עד-70 מקפיא ° c עבור > 5 h. זהירות להסיר ולהעביר את הבקבוקונים מצנצנת המקפיא התא ומקום במיכל אחסון חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך עד השימוש הבא . הזן מידע על שם הקו הנייד, את המיקום במיכל ואת התאריך בגיליון המעבדה נוזלי מעבדה חנקן. 2. הכנת שכבת ממזין 3T3 לקרני רנטגן הקרנה וזריעת להכין תאים 3T3 שבוע לפני ההקרנה שלהם ולאפשר להם לגדול ~ 100% המפגש. התאים 3T3 הם בדרך כלל בתוך מעברים של 120 כדי 130. עבור מוצלח הclonogenic בחני העיקרי keratinocytes, לפני זריעת 3t3 תאים, מעיל משטח את 60 mm מנות פטרי עם קולגן. Pipet סביב 2 – 3 מ ל של התמיסה ציפוי קולגן לתוך 60 mm מנות פטרי לעיל את המשטח התחתון ולהסיר את עודף קולגן ציפוי נוזלי (לראות את שולחן 1). העבירו את מנות פטרי לחממה ב37 ° c עם 5% CO2 למינימום של 1 h. אל תתנו לכלים להתייבש בחממה. הקרנות רנטגן צעד: בצע את שלבים 1.4 – 1.6. השתמש 50 mL של CGM טרי כדי להשעות מחדש את הגלולה התא, לסגור את צינור חרוט וחותם עם פרפין איטום הסרט. כדי למנוע כל זיהום, להשתמש בשקיות פלסטיק לשקית כפולה של התא האטום פרפין המכיל צינורית ומקום על הקרח. ניתן להשתמש בשכבת ממזין חלופית מיטומיצין המבוססת על תרבות של keratinocyte7. הרכבת התאים 3T3 הפיצוץ בצינור 50 mL עם 5,000 rads (50 Cgy) מינון עם מכונת רנטגן ביולוגית. הקרין תאים אלה יחד עם מדיית CGM. בעקבות הקרנה רנטגן, בתאי צנטריפוגה ב 160 X g עבור 7 דקות ב 4 ° c. מנושף את מדיית הסופרנטאנט ומשהה בעדינות את הגלולה הסלולרית עם 5 מ ל של CGM triturating בעדינות ~ 10x. עכשיו להביא את הנפח הסופי ל 30 מ ל עם תוספת של 25 מ ל של בינוני ו קצוצות 10x. הצעדים האלה הם חיוניים עבור שכבת 3T3 אחידה פיברולסט לצורך המשך שיטת הקלאוגניות. לספור תא קיימא: לספור את keratinocytes באמצעות מכשיר זכוכית רגיל. קחו כ 0.5 מ ל של תאים ומקום לתוך שפופרת 1.5 mL. הסר 200 μL של תערובת התא והוסף נפח שווה של 0.4% הפתרון הכחול של טרימין ותערובת 3 – 4x. העבר תאים עם המעי ולספור את כל התאים הנוקלאובטים (זהב קטן ורוד תאים) כמו תאים קיימא. לחשב את הריכוז הסופי של תאי זהב קיימא. הפיפטה 1 x 106 3t3 תאים (מינימום של 7 x 105) תאים עשויים לשמש) לתוך 60 mm קולגן מצופה מנות פטרי (שלב 2.2) ולהוסיף בעדינות 4 מ ל של מדיה משתנה גבוהה סידן ויליאמס (ראה טבלה 1). אפשר תאים 3T3 טריים הנזרע לצרף עבור 24 h. ביום למחרת, הקציר החדש keratinocyte הראשי והזרע אותם על גבי שכבת 3T3 פיברובסט המצורפת לצורך שיטת כליית המחשב כפי שמצוין להלן. 3. קציר וזריעת היסוד הראשוני המתת חסד ארבע עד חמש עכברים נקבה מבוגרים באמצעות CO2 אינהלציה על פי מתקן בעלי חיים מאושר/סטנדרטים iacuc. עם זאת, פרוטוקול זה עשוי לשמש גם עבור עכברים בודדים/זכרים. קליפ כ 9 ס מ2 של פרווה על הראש עם קליפר בעלי חיים חשמליים ומניחים את כל העכברים החתוכים לצנצנת 500 mL עם מספיק povidone יוד פתרון חיטוי (לא לשפשף) כדי לכסות אותם 1 – 2 דקות. לנער את הצנצנת היטב כדי המעיל שווה את החיטוי פתרון על העכברים. שופכים את הפתרון ולשטוף עם מים נקיים עד הנוזל רץ ברור. חזור על אותו שטף אנטיספטי שלאחריו שטפו מים. לאחר שטיפת אנטיספטית עם הפתרון יוד, להשרות את כל העכברים ב 70% אתנול עבור 5 – 10 דקות.הערה: עכברים בעלי פרווה בהיר (g., BALB/c) ישמור על צבע צהבהב קל מפני שטיפת יוד חיטוי, בעוד עכברים כהים (למשל, C57BL/6) לא. בעיקר, הכדאיות התאית או צמיחת התרבות אינה מושפעת עקב הצבע הצהוב. הסר בזהירות את העור החתוך בעזרת מלקחיים ומספריים של האגודל במכסה של זרם למינארי. מניחים את העור הממולא בצינור החרוט ממולא ב-PBS/2x. הימנע משימוש בעור הצד הגחוני כדי למנוע זיהום של תאי החלב בתרבות. באמצעות מלקחיים אוטוקלשים ואזמל, מניחים עור באורך אחד בזמן השעיר למטה אל צלחת פטרי דקה. התחל לגרד את כל הרקמה התת עורית כולל שומן בצד הגחוני של רקמת העור עד שהוא חצי שקוף. לנסות להסיר עקבות מקסימלית של רקמה תת עורית בלי לקרוע את העור (זקיק השיער חלק). כמו כן, לא לגרד זמן רב ולהימנע ייבוש העור. שמרו על עור מעובד בתמיסת PBS עד שכל שאר העורות הנותרים יעובדו. באמצעות אזמל, מעטפת פרוסה לתוך 0.5 ס”מ x 1 – 1.5 ס מ רצועות ומניחים את הצד השעיר למעלה על צלחת פטרי סטרילית. פיפטה בזהירות 20 מ ל של הפתרון Gentamicin/2x של PBS מעורב עם טריפסין (0.25%) לצלחת פטרי מפלסטיק בעובי של 100 מ”מ. באמצעות מלקחיים סטריליים, להעביר את העורות ולהציף אותם בצד השעיר על פני השטח של טריפסין פתרון 2 h בחממה 32 ° c.הערה: טריזיזציה הזמן והטמפרטורה חיוניים לתשואה טובה של keratinocytes ראשוניים מאוד. למרות שיטות אחרות עשויות לספק תשואות טובות של תאים קיימא, היכולת המועלת של keratinocytes היה פחות משביע רצון. במהלך זה 2 h הדגירה זמן, מנות מעיל עם ציפוי קולגן למקם אותם ב 37 ° צ’ עבור 1 h (ראה שלב 3.1.2). עבור הclonogenic assays, 60 מ”מ מנות פטרי כבר מצופה 24 שעות לפני הקציר keratinocyte כדי לאפשר את שכבת המזין הקרינה 3T3 לצרף לתחתית ולהתפשט באופן שווה.הערה: ציפוי של מנות תרבות לתרבות הclonogenic חשוב מאוד עבור ההחזקה הנכונה, היווצרות המושבה, ואת הצמיחה האולטימטיבית/התפשטות של עכברים באפידרמיס keratinocytes. צעד ציסטות עוריות: לסדר צלחת פלסטיק סטרילית מרובע פטרי וליצור משטח בשיפוע של 30 ° עבור גירוד באפידרמיס הנכון עם 15 מ ל של קציר בינוני (לראות שולחן 1). הסירו בזהירות רצועת עור צפה מתמיסה טריפסין עם מלקחיים מעוקלים. , עם להב אזמל חדש. מגרדים את האפידרמיס והשערות למדיום אין להשתמש בכח מופרז, אבל להשתמש בכוח מספיק כדי לגרד את האפידרמיס, או שזה ישפיע על הכדאיות של התא. במהלך גירוד האפידרמיס, השאר את הלהב בניצב לחלק העור. אם הלהב הוא בזווית לכיוון התנועה של הלהב, יש סיכוי רב יותר של עור קורע. אם הלהב הוא בזווית הרחק התנועה להב, יש סיכוי רב יותר של הסרת אפידרמיס מספיק. בזהירות למזוג את המדיום קציר המכיל תאים באפידרמיס מגורד לתוך צנצנת 60 mL סטרילי (autoclavable לשימוש חוזר) עם 1.5 אינץ ‘ מגנטי לערבב בר. לשטוף את צלחת פטרי עם בינוני קציר נוסף כדי לאסוף תאים באפידרמיס הנותרים ולהביא את הנפח הסופי 30 מ ל. השתמש במערבב מגנטי ומערבבים ב 100 סל ד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. תהליך זה יסיר את התאים באפידרמיס לכודים מן השערות. מניחים מסננת תאים סטרילי 70 יקרומטר על החלק העליון של צינור השפופרת של 50 mL. מסננת התא מתאים מעל שפופרת חרוט 50 mL. . קח את הצנצנת לתוך מכסה ביולוגי הסר את שורת המהומה ויוצקים את התוכן למסנן מסננת המצורף לשפופרת חרוט 50 mL. מסננים החוצה שיער לא רצוי גיליונות של שכבה הקרנית. לחצו על השערות יחד עם הרובד חומרים הקרנית בתוך מסננת ולתמרן אותם כדי לשחרר את התאים שיער לכוד. השתמש 5 mL של קצירת בינונית כדי לאפשר לשאר תאים לכודים לשחרר ולזרום לתוך הצינור. הביאו את אמצעי האחסון הכולל עד 50 mL בשפופרת חרוט. Cap 50 מ”ל שפופרת חרוטי עם התאים פילטרט וצנטריפוגה ב 160 x g עבור 7 דקות ב 4 ° c. ולאחר מכן להוסיף 5 מ ל של קציר בינוני. להשעות מחדש את הגלולה על ידי triturating בעדינות ~ 20x עם 5 mL pipet. בשלב זה, לשמור את התאים במקרר כדי למנוע צבירה כלשהי. הוסף 25 מ ל של קציר בינוני ו קצוצות שוב (20 – 25x). כדי להבטיח ספירה keratinocyte מדויק בשלב זה, לקחת 1 מ ל של השעיה התא ולהוסיף 19 מדיום קציר בינוני. עכשיו הדילול התא הוא 1:20 בתוך 50 mL שפופרת חרוט. אם keratinocytes נקצרו מעכבר בודד, להתאים את העוצמה של ההשעיה התא. במקום 30 מ”ל, השתמש 15 mL ולעשות דילול 1:10 עבור ספירת התאים. Pipet 0.5 mL של תאים מדולל מצינור 50 mL (1:20 דילול) והעברה לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה ב1.5 צורת mL. הסרת 0.2 mL (200 μL) של שילוב התא לתוך שפופרת מיקרו-מיקרוצנטריפוגה אחרת 1.5 mL ולהוסיף נפח שווה (200 μL) של 0.4% טרימין כחול פתרון. בעדינות לערבב את הפתרון הזה 3x ולהעביר תאים הומוציטוטומטר עבור ספירת keratinocytes. ציון כל התאים הכחולים כחול חיובי עבור טרילון כחול כמו תאים מתים לא קיימא, וציון תאים קטנים זהב ורדרד כמו תאים קיימא. התשואה keratinocyte הסופי לכל עכבר צריך להיות סביב 30,000,000 תאים קיימא. צנטריפוגה את הצינור המקורי 50 mL (משלב 3.8) עבור 7 דקות ב 160 x g ב 4 ° c. בשלב זה, השהה מחדש את התאים במדיום הרצוי והפוך את הדילול הנדרש לזריעת תאים. עבור תרבות ההמונים, זרע 2 כדי 4,000,000 תאי זהב קיימא בכל צלחת פטרי 35 מ”מ במדיום תרבות התא (כגון kgm-סוג בינוני + תוספי עבור תרבויות דופלקס) (ראה טבלה 1). עבור שיטת כclonogenic היווצרות המושבה), הזרע 1,000 תאים לכל 60 מ”מ צלחת פטרי על X-ray הקרינה שוויצרי העכבר 3T3 ממזין שכבות עם ציפוי קולגן שונה של ויליאם E בינונית עם תוספי וסרום. השתמש בסך הכל 2 כדי 4 מ”ל בינונית עבור 35 מ”מ ו 60 מ”מ מנות פטרי, בהתאמה. כמו כן, לנסח DMEM גברת ויליאמס E מדיום רכש מ ATCC עם רמות מופחתת של נתרן ביקרבונט לשימוש ב 5% CO2. לגדל את תאי התרבות (מסה או clonogenic) ב 32 ° c, 95% לחות עם 5% CO2. שנה את המדיה יום אחד לאחר הזריעה הראשונית של תרבות ההמונים, ולאחר מכן שלושה x שבועי לאחר מכן. עם זאת, עבור שבטים מסוימים, השינוי הבינוני הראשון הוא 2 ימים לאחר זריעת תאים ו-3x שבועי לאחר מכן. לתרבות שבטיים, מטפחים תאים במרווחי זמן של שניים וארבעה שבועות. לאחר סיום התרבויות השובטים (2 או 4 שבועות), מנושף את המדיום. לתקן את המושבות ב 10% פורמלין באגירה לילה בטמפרטורת החדר ומכתים עם 0.5% rhodamine B ב מים החיטוי עבור 1 h. לאחר מכן, הסר את הכתם הרומדורין B עם פיפטה משולי הכלים. שטפו את המנות במים בהירים וקרים, עד שהמנות מפנות. הניחו את הכלים על מכסה הכלים והניחו להם להתייבש לצורך ספירת המושבה הסופית. בעיקר, כאשר ביצוע שיטת התרבות הclonogenic, לעולם לא pipet < 1 mL של תאים. אם התאים מרוכזים, מדלל באופן סדרתי את ריכוז התא.
Representative Results
בדרך כלל, תשואות של keratinocytes באפידרמיס לעכבר החל מ 20 x 106 כדי 30 x 106 טרילון כחול למעט תאים מתקבלים8,9. הכדאיות נעה בין 80%-90%. הקרינה האופיינית לזריעה הם סביב 30% מצורף 24 שעות ביממה. היווצרות המושבה על שכבות ממזין 3T3 הוקרן הוא סביב 60 מושבות לכל 1,000 תאים קיימא שנזרע עבור C57BL/6 עכברים, ו כ 30 מושבות לתאים 1,000 עבור עכברים מסוג שוויצרי10 ,11. התוצאות האופייניות ממערך המושבה מומחשות באיור 1. מספר תאי גזע שיער זקיק הוא כ 9% CD34+/cd49f+ תאי גזע עבור C57BL/6 עכברים12. תוצאות טיפוסיות מתוך הזרימה cy, מקבלים באיור 2. מאפייני צמיחה של ארבעה מדיה שונים מומחשים באיור 3. התקשורת נבדקה כולל KGM-gold, SFM, המדיום E של ויליאם, ו-מוריס -2 (בינוני סידן מופחת שפותחה במעבדה מוריס מבוסס על ויליאמס E). איור 1: דוגמאות מייצגות מתוך שיטת הפעולה של מספר העכברים הבגירים. צילום זה מדגים את היווצרות המושבה keratinocyte מ-CD-1 עכברים נקבה 54 ימים של גיל שטופלו למריחה עם 1) אין טיפול, 2) אצטון ואחריו שבוע לאחר מכן על ידי אצטון פעמיים בשבוע במשך שבועיים, 3. DMBA שלאחר מכן שבוע לאחר מכן על ידי אצטון פעמיים בשבוע במשך שבועיים, 4) אצטון בעקבות שבוע לאחר מכן על ידי הסברתי פעמיים שבועי במשך שבועיים, ו-5) DMBA בעקבות שבוע לאחר מכן על ידי הסברתי פעמיים שבועי לשבועיים. לאחר שלהם טיפולים vivo, שנקטפו keratinocytes והזרע ב 1,000 תאים לכל מנה על שכבות מאכל של 3t3 הוקרן, ומתורבת במשך שבועיים, לאחר מכן הכלים היו קבועים עם פורמלין ומוכתם עם rhodamine B. הכלים בכל עמודה משכפל כל אחת מקבוצות הטיפול בעכבר. שים לב כי מספר מושבות גדולות גדל על הטיפול עם DMBA, ואת המספר הכולל של מושבות גדל הסברתי טיפול של העכברים לפני הקציר keratinocyte. קיצורים: DMBA: 7, 12-דימתילבנץ [a] פחם; הסברתי: 12-ו-טטרדאנולילפורובול-13-אצטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: הדוגמה הנציגה של cy, להזרים הזרע של תאי גזע שיער מעכברים למבוגרים. בקצרה, keratinocytes הראשי מבודדים היו מבודדים מעור העכברים האלה מסוננים לפסולת תאית באמצעות מסנן התא. ההשעיה keratinocyte מבודדים היה מתויג עם CD49f או α6-אינטגרציה (PE) ו CD34 (FITC) נוגדנים יחד עם צבע חי מת ובקרות אחרות. השימוש בנוגדנים מסוג FITC ו-PE (Rat IgG2akappa) שימשו למטרת פיצוי (ראה טבלת חומרים). תאי גזע נבחרו באמצעות CD49f (PE ערוץ), אשר זיהה את הרכיב החיצוני של המי-desmosomes שנמצאו על בסיס באפידרמיס ובתאי זקיק השיער, ו CD34 (הערוץ FITC), אשר זיהה את תאי גזע השיער זקיק (כלומר, CD34-FITC+ ו-a6-PE+ (עמודה ימנית עליונה, סה כ 5%)). העמודה בצד ימין מראה את אוכלוסיות keratinocyte שונים כלומר CD34-FITC בלבד, CD34-FITC ו a6-PE תאים (כפול חיובי תא גזע האוכלוסיה), a6-PE בלבד, ותאים בלתי מוכתם. שים לב שיש שני CD34+ אוכלוסיות של תאי גזע כפי שדווחו6,14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: השוואה בין ארבעה מדיה שונים על התרבויות העיקריות של תאים באפידרמיס מפני עכברים נקבה מבוגרת. הkeratinocytes העיקרי היו מבודדים מהעור עכברים מעורבי ונספרו לזריעה באמצעות ארבעה מדיה שונים (KGM, SFM, וילם-E ומוריס -2). מספר שווה של keratinocytes הופרה ואחריו המבנה הכללי שלהם דפוס הצמיחה. שים לב keratinocytes מתרבים יש מעט שונה מורפולוגיות. KGM, SFM, ו-מוריס -2 כולם מופחת מדיה סידן יש את הצמיחה החזקה ביותר לאחר 14 ימים. לעומת זאת, התאים אינם ממשיכות כאשר מתורבתים במדיום E ויליאמס כי יש 1.4 מ”מ סידן ויחס גבוה של אשלגן כדי נתרן. באופן מפתיע, ויליאמס E בינוני עם תוספי ועשרים אחוז העובר סרום העוברי תומך בתרבויות שבטים keratinocyte הרבה יותר טוב מכל בינוני אחר נבדק, כנראה בגלל מועשר ויליאמס E בינונית מסייע התאים 3T3 המזין “להאכיל” טוב יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. פתרונות ומדיה ערות פתרונות קצירת מזון 2.5% טריפסין (5 מ ל) הערוץ הPBS של דולבוקו (500 mL) גנאמיצין (2 מ ל) PBS עם 2x הגברות (45 mL) תמיסת מלח באגירה מפוספז (PBS) עם 2x בעלי בנייה טריפסין תמיסה פתרונות לתרבות התאים מיכל הציפוי-מענה: 1 M הפסי (1 מ ל) 116 מ”מ CaCl2 (1 mL) סרום של שור 1.0 mg/mL (10 מ”ל) בינונית תרבותית של תאים (100 mL) פיברוטין (1 מ ג) קולגן לנפיחות (1 מ ל) פתרון הקפאת תא (2 מ ל) Dמאמ עם 10% BCS ו-עט-דלקת קציר בינוני צריך להיות ללא סידן 2x שאמיאמצין (1 מ ל) FBS (50 mL) סמימ (500 mL) התקשורת האלקטרונית של ויליאמס High-סידן עם: EGF (5 μg/mL) 1 mL גלוטמין 14.5 mL הידרוקורטיזון (1 מ”ג/mL) 0.5 mL אינסולין 1 מ ל לינאואסיד-BSA (0.1 mg/mL) 0.5 mL חומצות אמינו 4 מ ל ויטמינים של הגברת 5 מ ל פניצילין-סטרפטומיצין 5 מ ל העברת (5mg/mL) 1 mL ויט A (1 מ”ג/1000 μL) 57.5 μL Vit E 1 mg/mL (4 ° צ’) 3.5 μL Vit D2 (10 מ”ג/mL) 50 μL 3T3 פיברובלסט בינונית צמיחה מלאה (CGM) סינכרון BCS (100 mL) DMEM (900 mL) פניצילין-סטרפטומיצין (10 מ”ל) KGM בינונית המשמשת לתרבות המונית היא בינונית-סידן מופחתת מוריס 2 בינוני עם תוספי אותו כמו ויליאמס ‘ E גרסה מופחתת של סידן של ויליאמס E עם תוספי טבלה 1: מתכוני פתרונות ומדיה.
Discussion
שיטת הקציר keratinocyte תיאר כאן פותחה כדי לייצר תשואה גבוהה של keratinocyte ראשונית באפידרמיס העיקרי מאחורי של עכברים נקבה בוגרים. אלה keratinocytes מתאימים לזרימה cy, ליישום הביולוגיה המולקולרית, ואת התרבות התא הראשוני, כולל את הבקשה הclonogenic דיווחו כאן. זו שיטת הקציר keratinocyte גם היה שימושי ללמוד היבטים במורד הזרם השני של מסרטנים כימיים קרצינובגנזה וקידום הגידול1,13.
קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, עבור הקשיחות והתוכסות, עכברים נקבה של גיל 54 ± 2 ימים שימשו. זה איפשר לנו לבצע מושבה רגישה וכמותית בחני מזנים מרובים של עכברים ולהשתמש בהם כפנוטיפ בניתוח הצמדה המוביל לזיהוי של לפחות תא גזע חדש אחד הרגולציה10,11. שנית, מועיל לחתוך את העורות לחתיכות קטנות יותר, מכיוון שהטריסיזציה יעילה יותר מלנסות לשמור על העור כולו. שלישית, הזמן וטמפרטורת הטריפסין. מאוד חשובים ליכולתם הבאה יתר על כן, האדם צריך “לתקוע באופן משמעותי” על השערות שנותרו על הפילטר לעקור את התאים המחוברים. שלב זה חשוב לקבל תשואות גבוהות של תאים. יתרה מזאת, הטמפרטורה 32 ° c של החממה חשובה לטיפוח ארוך טווח של keratinocytes מעכברים למבוגרים. בסופו של דבר, בפרוטוקול זה, הקריאות המקבילות של מבחנה ובניסויים vivo1 מבוססים על תרבויות ראשיות ולא על קווי משנה או של תאי תאים. בעיקר, אם קצירת keratinocytes הראשי בפעם הראשונה באמצעות פרוטוקול זה, לשמור על דרמיס הנותרים לאחר גירוד כדי לאשר את ההסרה המלאה של זקיקי השיער יחד עם האפידרמיס על ידי התבוננות histopathological.
החוזק העיקרי של פרוטוקול זה לקצירת keratinocytes עכבר למבוגרים היא כי הוא מייצר תשואות גבוהות של תאים מיועדים להיות מתאימים עבור יישומים רבים במורד הזרם. המגבלה העיקרית היא שחלק מהתאפיסקופים הסלולריים עשויים להיות רגישים לטריסיזציה, כך שניתן יהיה להתפשר על הנוגדנים. לכן, כאשר בדיקת נוגדן משטח התא חדש, זה עשוי להיות נבון להשתמש dispase6 או thermolysin5 שיטה מבוססת לקציר להשוואה. המשמעות של פרוטוקול זה היא כי הוא נבדק בקפדנות, בכמת, והוחל על יישומים מגוונים כאלה כמו בחני עבור תאי גזע clonogenic1,9,10,11, עבור תרבויות המוני בביוכימיה8, עבור מיון facs בניתוח תאי גזע3,4, עבור ביולוגיה מולקולרית3,12, ועל רצפי רנ א מתמשך ו-DNA רצף.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
למחברים אין ותודות.
Materials
| 0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
| 1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
| 1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
| 10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
| 2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
| 2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
| 2.5% Trypsin solution 10X | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
| 225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
| 32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
| 35-mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
| 5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
| 60-mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
| 70% ethanol | |||
| 90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
| Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
| Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
| Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
| CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
| CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
| Cell Strainer, 70-µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
| Collagen, Bovine, Type I, 30mg | BD Biosciences | 354231 | |
| CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
| Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
| KGM | Lonza | CC-3103 | |
| Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
| No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
| No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
| One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
| Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
| Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
| Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
| Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
| Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
| SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
| SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
| Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
| Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
| Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz | Triad Group | 10-8216 | |
| VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10 | VWR | 25384-324 | |
| Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
| Ziploc bag |
Referencias
- Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors. Investigación sobre el cáncer. 48 (22), 6285-6290 (1988).
- Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).
- Trempus, C. S., et al. Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).
- Redvers, R. P., Kaur, P. Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes. Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids. Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).
- Morris, R. J. . Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium. , (1994).
- Wu, W. Y., Morris, R. J. Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice. Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).
- Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis. Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).
- Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled. Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).
- Trempus, C. S., et al. Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells. Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).
- Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene. Investigación sobre el cáncer. 50 (10), 3048-3054 (1990).
- Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118 (5), 635-648 (2004).
Citar este artículo
Morris, R. J., Readio, N., Boland, K., Johnson, K., Lad, S., Singh, A., Singh, A., Holtorf, S., Skaar, S. Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture. J. Vis. Exp. (150), e58701, doi:10.3791/58701 (2019).