الاستخدام التكميلي للتقنيات المجهرية والقراءة الفلورية في دراسة تفاعلات Cryptococcus-Amoeba
Summary
هذه الورقة تفاصيل بروتوكول لإعداد ثقافة مشتركة من خلايا cryptococcal والأميبا التي يتم دراستها باستخدام الصور الفلورية لا يزال، والصور عالية الدقة نقل المجهر الإلكتروني. ويتضح هنا كيف يمكن للبيانات الكمية أن تكمل هذه المعلومات النوعية.
Abstract
لمحاكاة عدوى Cryptococcus، يمكن استخدام الأميبا، وهو المفترس الطبيعي لخلايا cryptococcal في البيئة، كنموذج للماكروفيج. هذا الكائن الحي المفترس، على غرار الضامة، يستخدم phagocytosis لقتل الخلايا الداخلية. مع مساعدة من مجهر الليزر المسح الضوئي، يتم التقاط الصور التي تصور لحظات تفاعلية بين خلايا cryptococcal والأميبا. قوة القرار من المجهر الإلكتروني يساعد أيضا على الكشف عن التفاصيل الهيكلية جدا من خلايا cryptococcal عندما المحاصرين داخل الفراغ الغذاء الأميبا. وبما أن الفياغوسية عملية مستمرة، ثم يتم دمج البيانات الكمية في التحليل لشرح ما يحدث في الوقت المناسب عندما يتم التقاط صورة. وعلى وجه التحديد، تُقرأ وحدات الفلورة النسبية من أجل تحديد كفاءة الأميبا في استيعاب خلايا الكريبتوك. لهذا الغرض، وملطخة خلايا cryptococcal مع صبغة التي تجعلها الفلورة مرة واحدة محاصرين داخل البيئة الحمضية من vacuole الغذاء. عند استخدامها معا، يمكن أن توفر المعلومات التي يتم جمعها من خلال هذه التقنيات معلومات حاسمة للمساعدة في استخلاص استنتاجات حول سلوك ومصير الخلايا عند استيعابها من قبل الأميبا، وربما، من قبل الخلايا الفيوسية الأخرى.
Introduction
وقد تطورت الميكروبات مع مرور الوقت لتحتل وتزدهر في منافذ إيكولوجية مختلفة مثل الحدود المادية المفتوحة للتربة والمياه، من بين أمور أخرى1. وفي هذه المنافذ، كثيرا ما تشارك الميكروبات في المنافسة المباشرة على الموارد المحدودة؛ الأهم من ذلك، للمغذيات التي يستخدمونها لدعم نموها أو الفضاء،والتي يحتاجونها لاستيعاب السكان الآخذة في التوسع 2،3. في بعض الحالات، قد بعض الكائنات الثلاثية الأبعاد مثل الأميبا حتى predate على خلايا cryptococcal كوسيلة لاستخراج المواد الغذائية من الكتلة الحيوية الخاصة بهم4،5. وهذا بدوره يسمح لهذه الكائنات بترسيخ الهيمنة الإقليمية عن طريق السيطرة على أعداد سكان فريستها. وبسبب هذا الضغط المفترس ، يمكن اختيار بعض الفرائس لإنتاج عوامل ميكروبية ، مثل كبسولة cryptococcal6، للتوفيق بين الآثار السلبية للضغط. ومع ذلك، كنتيجة غير مقصودة لهذا الضغط، بعض الميكروبات اكتساب العوامل التي تسمحلهم بعبور حاجز الأنواع والبحث عن منافذ جديدة لاستعمار 7، مثل المساحات المحصورة في جسم الإنسان التي هي غنية بالمواد الغذائية ولها مثالية الظروف. هذا الأخير قد يفسر كيف ميكروبالأرض مثل Cryptococcus (C.) يمكن أن تتحول neoformans لتصبح المسببة للأمراض.
لهذه الغاية، من المهم دراسة الاتصال الأولي أن خلايا cryptococcal قد يكون مع الأميبا وكيف يمكن أن تختار لهم لتصبح المسببة للأمراض. وبشكل أكثر تحديداً، قد يعطي هذا أدلة على كيفية تصرف خلايا الكريبتوككل عندما يتصرف عليها الضامة أثناء العدوى. ولهذا السبب تم اختيار الأميبا كنموذج للماكروفيج هنا ، حيث أنها رخيصة نسبيا وسهلة للحفاظ على ثقافة الأميبا في مختبر8. وكان من المهم أيضا أن تدرس كيف cryptococcal الأيض الثانوي أي 3-هيدروكسي الأحماض الدهنية9،10 تؤثر على التفاعل بين الأميبا وخلايا cryptococcal.
وهناك طريقة بسيطة لإدراك التفاعل بين الأميبا وفريستها بالعين المجردة هو إنشاء حديقة باستخدام فريستها على سطح لوحة أجار وبقعة الأميبا. يصور تصور اللوحات أو المناطق الواضحة على لوحة أجار المناطق التي قد تكون قد أطعمت فيها الأميبا فريستها. ومع ذلك، على هذا المستوى الكلي، يتم ملاحظة فقط نتيجة العملية، وعملية البلغم هو ميكانيكية لا يمكن ملاحظتها. لذلك، لتقدير العملية على أساس خلية إلى خلية، وهناك العديد من الطرق المجهرية التي يمكن استخدامها11،12. على سبيل المثال، يمكن استخدام المجهر المقلوب مع غرفة الحضانة لتسجيل الفيديو الفاصل الزمني للأحداث بين خلية phagocytic وهدفها13. لسوء الحظ، بسبب تكلفة المجهر مع وظيفة الفاصل الزمني، فإنه ليس من الممكن دائما للمختبرات لشراء مثل هذا المجهر، وخاصة في الموارد البيئات الفقيرة.
للتحايل على القيد المذكور أعلاه، تقدم هذه الدراسة تصميمًا استكشافيًا متسلسلًا يقيّم تفاعل C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 وC. neoformans LMPE 046 مع Acanthamoeba castellani . أولاً، يتم استخدام طريقة نوعية تسبق طريقة كمية. يتم التقاط الصور الثابتة باستخدام مجهر الفلورة المقلوب، فضلا عن المجهر الإلكتروني انتقال لتصوير التفاعلات الأميبا-Cryptococcus. وأعقب ذلك قياس الفلورة باستخدام قارئ لوحة لتقدير كفاءة الأميبا لاستيعاب خلايا الكريبتوكال. عند التوفيق بين النتائج من هذه الأساليب خلال مرحلة تفسير البيانات، وهذا قد يكشف بنفس القدر من المعلومات الحرجة مثل الاطلاع على شريط فيديو الفاصل الزمني phagocytosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الورقة، تم استخدام تقنيات مختلفة بنجاح للكشف عن النتيجة المحتملة التي قد تنشأ عندما تتفاعل الأميبا مع خلايا cryptococcal. أيضا، كنا مهتمين لإظهار آثار الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي على نتيجة تفاعلات Cryptococcus-الأميبا.
وكانت التقنية الأولى المستخدمة هي الفحص المجهري البؤري، ا?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وحظي العمل بدعم من منحة مقدمة من المؤسسة الوطنية للبحوث في جنوب أفريقيا (رقم المنحة: UID 87903) وجامعة الدولة الحرة. كما أننا ممتنون للخدمات والمساعدة التي يقدمها بيتر فان ويك وهانلي غروبلر خلال دراساتنا المجهرية.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
Referencias
- Barton, L. L., Northup, D. E. . Microbial Ecology. , (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?. Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. . Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. . Cryptococcus Neoformans. , (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. . The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. . Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. . Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
