Single-step очистка макромолекулярных комплексов с помощью РНК, биотин и фото горные компоновщика
Summary
РНК/белковых комплексов, очищенная с помощью Ботин стрептавидина стратегии являются этого eluted решение под денатурируя условия в форме неподобающе для дальнейшей очистки и функционального анализа. Здесь мы описываем изменения этой стратегии, которая использует фото горные компоновщика в РНК и нежный УФ элюции шаг, уступая родной и полностью функциональный РНК/белковых комплексов.
Abstract
На протяжении многих лет исключительно сильное и быстро формируется взаимодействие между биотина и стрептавидина успешно использовались для частичная очистка биологически важных РНК/белковых комплексов. Однако, эта стратегия страдает от одной основной недостаток, который ограничивает его широкого использования: биотин/стрептавидина взаимодействие может быть нарушена только при денатурации условий, которые также нарушают целостность eluted комплексов, следовательно исключающие их последующие функционального анализа и/или дальнейшей очистки другими методами. Кроме того образцы eluted часто загрязнены фон белки, связывающие nonspecifically с бисером стрептавидина, осложняет анализ комплексов очищенный Серебряный пятнать и масс-спектрометрии. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали вариант биотина/стрептавидина стратегии, в котором биотина прилагается к РНК субстрата через фото горные компоновщика и комплексы, иммобилизованных на стрептавидина бусины выборочно этого eluted решение в родной форме длинней волны УФ, оставив белки фон на бисер. Короткие РНК привязки субстратов могут быть синтезированы химически с биотина и фото горные компоновщик ковалентно прилагается к 5′ концу РНК, тогда как дольше субстратов РНК могут быть предоставлены с двумя группами взаимодополняющих олигонуклеотида. Эти два варианта метода УФ элюции были протестированы для очистки U7 snRNP зависимых обработки комплексов, которые прилепится гистона пре мРНК в конце 3′, и они оба оказались выгодно для других ранее развитых методов очищения. Образцы этого eluted УФ содержатся легко обнаружить количество U7 snRNP, который был свободным от крупных белковых загрязнений и подходит для прямого анализа по масс-спектрометрии и функциональных анализов. Описан метод можно легко адаптированы для очистки других комплексов связывания РНК и используется в сочетании с одно – и двуцепочечной ДНК привязки сайтов для очистки ДНК специфических белков и макромолекулярных комплексов.
Introduction
В эукариот РНК-полимераза II генерируемые мРНК прекурсоров (пре мРНК) проходят несколько событий созревания в ядре прежде чем стать полностью функциональной мРНК шаблоны для синтеза белка в цитоплазме. Одно из этих событий является 3′ конца обработки. Для подавляющего большинства из пре мРНК 3′ конца обработка включает расщепления в сочетании с сплайсингу. Эта реакция двухэтапный катализируемой относительно обильные комплекс состоящий из более чем 15 белки1. В конце 3′ животных зависит от репликации гистона пре мРНК обрабатываются другим механизмом, в которой ключевую роль играет U7 snRNP, низкие изобилии комплекс, состоящий из U7 мяРНК ~ 60 нуклеотидов и несколько белки2,3 . U7 мяРНК низкопробных пар с определенной последовательности гистона пре мРНК и одним из подразделений U7 snRNP катализирует реакцию расщепления, генерации Зрелые гистона мРНК без poly(A) хвост. 3′ конца обработка гистона пре мРНК также требует стволовых-петля привязки белка (SLBP), которая связывает сохранение стволовых петля расположен выше по течению от расщепления сайта и повышает вербовки U7 snRNP субстрат2,3. Исследования, направленные на выявление отдельных компонентов U7 snRNP были сложной из-за низкой концентрации U7 snRNP в животных клетках и тенденция комплекса отмежеваться или проходят частичное протеолиза во время очистки в результате использования мягкий моющих средств4,5,6, высокая соли моет и/или несколько хроматографического шаги7,8,9.
Недавно чтобы определить состав механизма обработки зависящих от U7, короткий фрагмент гистона пре мРНК содержащие биотин на 3 или 5′ был инкубировали с ядерной экстракта и собрал комплексы были захвачены на стрептавидина покрытием агарозы бусины5,6,10. Благодаря исключительно сильное взаимодействие между биотина и стрептавидина белки, иммобилизованных на стрептавидина бусины были этого eluted под денатурации условий путем кипячения в ПБ и проанализированы Серебряные пятная и масс-спектрометрии. Хотя этот простой подход был выявлен ряд компонентов U7 snRNP, она дала относительно сырой образцы, часто загрязненные большое количество белков фон nonspecifically обязан стрептавидина бусы, потенциально маскировать некоторые компоненты Оборудование обработки и предотвращения их обнаружения на серебро витражные гели5,6,10. Важно отметить, что этот подход также исключается какие-либо функциональные исследования с изолированной материала и его дальнейшей очистки до однородности дополнительные методы.
Был предложен ряд изменений с течением времени для решения практически необратимый характер взаимодействия биотина/стрептавидина, с большинством из них разрабатывается либо ослабить взаимодействия или предоставлять химически горные распорку руку в биотин содержащих реагентов11,12. Недостаток всех этих изменений был, что они значительно снижают эффективность метод или часто требуется-физиологические условия во время шага элюции, ставит под угрозу целостность или активность очищенных белков.
Здесь мы описываем другой подход для решения проблемы присущие биотина/стрептавидина стратегии с помощью РНК субстратах, в которых биотина ковалентно прилагается к 5′ конца через фото горные 1-(2-нитрофенил) этилового остаток, который чувствителен к длиной волны УФ13,14. Мы протестировали этот подход для очистки ограничения механизма обработки U7 зависящих от дрозофилы и млекопитающих ядерной извлекает15. После короткого инкубационного гистона пре мРНК содержащие биотин и фото горные компоновщик с ядерной экстракт собранный обработки комплексы иммобилизованных на стрептавидина бусы, тщательно промывают и аккуратно выпустила решение в родной форма под воздействием ~ 360 Нм УФ света. УФ элюции метод очень эффективный, быстрый и простой, давая достаточное количество U7 snRNP, чтобы визуализировать его компоненты ленты, окрашивания как 100 мкл экстракт15. Материал этого eluted УФ бесплатно фон белков и подходит для анализа прямых масс-спектрометрии, дополнительной очистки шагов и ферментативные анализов. Тот же метод может быть принят для очистки других РНК/белковых комплексов, которые требуют относительно короткий сайтов связывания РНК. Биотин и фото горные Компоновщик может быть ковалентно присоединен к одно – и двуцепочечной ДНК, потенциально расширения УФ элюции метод для очистки различных комплексов ДНК/белок.
Химический синтез РНК субстраты, содержащие ковалентно придает биотина и фото горные компоновщик практических только с последовательностей, не превышающие ~ 65 нуклеотидов, становится дорогим и неэффективным для значительно более последовательностей. Для решения этой проблемы, мы также разработали альтернативный подход, который подходит для гораздо больше РНК цели привязки. В этом подходе РНК любой длины и нуклеотидной последовательности является созданный в пробирке , транскрипции T7 или SP6 и отжигом для нескольких взаимодополняющих олигонуклеотида, содержащий биотина и фото горные компоновщика в конце 5′ (транс Конфигурация). Результирующая дуплекс впоследствии используется для очистки отдельных связывания белков или макромолекулярных комплексов на стрептавидина бусы после тот же протокол, описанные для РНК субстраты, содержащие фото горные биотин, придает ковалентно (СНГ конфигурации). С этой модификации фото горные биотина может использоваться в сочетании с в пробирке создан стенограммы, содержащих сотни нуклеотидов, расширяя УФ элюции метод для очистки из широкого диапазона РНК/белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь является простой и помимо включения фото горные компоновщика и УФ элюции шаг не отличаются от используемых методов, которые принимают преимущество чрезвычайно сильное взаимодействие между биотина и стрептавидина. УФ элюции шаг является очень эффективным, обычн…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим наших коллег и партнеров за их вклад в нашу работу. Это исследование было поддержано NIH Грант GM 29832.
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
Referencias
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d’Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3′ end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 ‘-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 ‘-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2′- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 ‘-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5′-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ‘ exonuclease that specifically interacts with the 3 ‘ end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3’hExo, a 3′ exonuclease specifically interacting with the 3′ end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3’hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3′ end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ‘ end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3′ processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L’Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3′ end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
