Summary

原代人细胞中寨卡病毒抗体依赖性增强的定量研究

Published: January 18, 2019
doi:

Summary

我们描述了一种方法来评估现有的免疫对登革热病毒感染的影响, 使用人血清, 原代人类细胞, 和感染定量定量定量定量定量定量定量定量定量定量定量定量定量的定量。

Abstract

最近出现的黄病毒寨卡和神经并发症, 如桂林-巴雷综合征和婴儿小脑, 带来了严重的公共安全问题。在危险因素中, 抗体依赖性增强 (ade) 构成了最严重的威胁, 因为最近寨卡病毒 (zikv) 的重新出现主要发生在人群接触过的地区, 处于对其他密切相关的人群的免疫前状态病毒, 尤其是登革热病毒 (denv)。在这里, 我们描述了一个程序, 量化人类血清抗体对初级人类细胞或细胞系的 zikv 感染的影响。

Introduction

在蚊子传播的病毒性疾病中, 寨卡感染是临床上最重要的疾病之一。感染是由黄病毒 zikv 引起的, 在大多数情况下, 黄病毒使用埃及伊蚊作为其主要载体1,2。然而, 有研究报告白纹伊蚊是一些 zikv疫情3的主要媒介。虽然感染在许多情况下是无症状的, 但最常见的症状是发烧、头痛和肌肉疼痛2。没有治疗或疫苗可用于 zikv 感染, 现有的治疗方法大多是支持性的。最近在南美洲爆发的 zikv 导致了严重的病例, 并使被称为 “小脑2″ 的胎儿的神经发育障碍增加了大约20倍。由于南美洲是 denv 和西尼罗河病毒等几种弓形虫病毒的特有地区, 因此调查先前对其他黄病毒的免疫力是否在 zikv 感染和疾病的严重程度中起着重要作用至关重要。

随着年龄的增长, 病毒已经进化出不同的策略, 以增加其感染的机会, 以接管宿主细胞机械, 并抑制抗病毒反应。其中最引人入胜的是利用宿主免疫前抗体的病毒, 以提高其复制与现象 ade 4.在 denv 的所有四个血清型中, ade 都得到了很好的研究和证明, 以增加病毒滴度和疾病结果5, 6,7.在先前的体外研究中, 我们已经证明了 zikv 复制的显著增强, 由于已有的 denv 免疫在原代人类免疫细胞8。我们还演示了一种相关的体外方法来量化 denv 先前存在的抗体增强初级细胞 zikv 复制的能力。

我们开发的协议使用在 tcid-50 或斑块还原中和试验 (prnt) 检测中和测试的人类血清样本, 以及在生物相关的细胞或从 zikv 可以感染的组织中提取的细胞中使用 zikv。

Protocol

本研究中使用的血清样本来自哥伦比亚一个群体的人类参与者。项目收集工作得到了潘普洛纳大学 (南美洲哥伦比亚) 和洛斯波蒂奥斯医院8号内部审查委员会的批准。这些样本是匿名提供的, 调查人员无法获得病人信息。对血清样本进行了 denv 血清型检测。这些样本进一步证实在体外中和中和 denv 感染。为了进行控制, 使用了来自美国健康人 (hc) 的血清样本。 <p class="jove…

Representative Results

在图 1中, 有一个逐步的图表, 说明了执行 ade 协议所涉及的所有步骤。这是一个示意图, 显示了整个过程的 zikv 由于预先存在的对 denv 的免疫力。图 2显示了人类血清样本如何分为三组: denv 感染确认样本被称为 denv 感染组, denv 抗体确认样本被称为 denv 暴露组, 健康没有 denv 中和抗体或 rna 的个体血清称为健康控制 (hc) 组。(<strong c…

Discussion

denv 抗体的交叉反应导致其他 denv 血清型的 ade 阻碍了有效疫苗开发11。zikv 属于同一家族, flaviviridae, 与其他黄病毒, 特别是 denv12有相当多的同源性。zikv 和 denv 中和抗体的主要目标是包络蛋白, 它在这两种病毒131415之间共享一个非常高的结构和四元序列同源。已经证明, 前免疫要么 denv …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了 1R21AI129881-01 (对 t. m. c.)、国家新兴传染病实验室和波士顿大学医学院启动资金的慷慨支持。

Materials

Fetal Bovine Serum  GEMINI 100-106
iCycler  BioRad 785BR02188 Model No. CFX96 Optics Module
Microfuge 18 Centrifuge Beckman Coulter  367160
Nanodrop-1000 Thermoscientific  1072
Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit  Qiagen  204154 Used for 1 step RT-qPCR
RNeasy RNA Isolation Kit  Qiagen  74106 Used for RNA extraction
RPMI-medium  Gibco 11875093

Referencias

  1. Hayes, E. B. Zika virus outside Africa. Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).
  2. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  3. Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas–Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
  4. Hawkes, R. A. Enhancement of the Infectivity of Arboviruses by Specific Antisera Produced in Domestic Fowls. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 42, 465-482 (1964).
  5. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 487-524 (2016).
  6. Vaughn, D. W., et al. Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. The Journal of Infectious Diseases. 181 (1), 2-9 (2000).
  7. Khandia, R., et al. Modulation of Dengue/Zika Virus Pathogenicity by Antibody-Dependent Enhancement and Strategies to Protect Against Enhancement in Zika Virus Infection. Frontiers of Immunology. 9, 597 (2018).
  8. Londono-Renteria, B., et al. A relevant in vitro human model for the study of Zika virus antibody-dependent enhancement. Journal of General Virology. 98 (7), 1702-1712 (2017).
  9. Ganger, M. T., Dietz, G. D., Ewing, S. J. A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments. BMC Bioinformatics. 18 (1), 534 (2017).
  10. Renn, L. A., et al. High-throughput quantitative real-time RT-PCR assay for determining expression profiles of types I and III interferon subtypes. Journal of Visualized Experiments. (97), e52650 (2015).
  11. McArthur, M. A., et al. Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates. Expert Review of Vaccines. 12 (8), 933-953 (2013).
  12. Priyamvada, L., et al. Humoral cross-reactivity between Zika and dengue viruses: implications for protection and pathology. Emerging Microbes and Infections. 6 (5), 33 (2017).
  13. Dai, L., et al. Molecular basis of antibody-mediated neutralization and protection against flavivirus. IUBMB Life. 68 (10), 783-791 (2016).
  14. Dai, L., et al. Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody. Cell Host & Microbe. 19 (5), 696-704 (2016).
  15. Sirohi, D., et al. The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
  16. George, J., et al. Prior Exposure to Zika Virus Significantly Enhances Peak Dengue-2 Viremia in Rhesus Macaques. Scientific Reports. 7 (1), 10498 (2017).
  17. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. Journal of General Virology. 71, 2909-2914 (1990).
  18. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  19. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7852-7857 (2016).
  20. Charles, A. S., Christofferson, R. C. Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro. PLoS Currents. 8, (2016).
  21. Swanstrom, J. A., et al. Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus. MBio. 7 (4), (2016).

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Asad, S., Feitosa-Suntheimer, F., Gold, A., Londono-Renteria, B., Colpitts, T. M. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (143), e58691, doi:10.3791/58691 (2019).

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