Identifiering av kodning och icke-kodande RNA klasser uttryckta i svin helblod
Summary
Här presenterar vi ett protokoll optimerad för bearbetning av kodning (mRNA) och icke-kodande (ncRNA) globinzinkinsulin minskat RNA-seq bibliotek från ett enda hela blodprov.
Abstract
Tillkomsten av innovativ och allt mer kraftfulla nästa generations sekvensering teknik har öppnat nya vägar till möjlighet att undersöka de underliggande genuttryck relaterade till biologiska processer av intresse. Dessa innovationer inte bara tillåter forskare att iaktta uttryck från de mRNA-sekvenser som kodar för gener att effekt cellulär funktion, men också de icke-kodande RNA (ncRNA)-molekyler som förblir oöversatta, men ändå har tillsynsuppgifter. Även om forskare har möjlighet att iaktta både mRNA och ncRNA uttryck, har det varit brukligt för en studie för att fokusera på ena eller andra. Men när studierna är intresserad av både mRNA och ncRNA uttryck, använda många gånger de separata prover för att undersöka antingen kodning eller icke-kodande RNAs på grund av skillnaden i biblioteket preparat. Detta kan leda till behov av fler prover som kan öka tid, förbrukningsvaror och djurens stress. Det kan dessutom orsaka forskare att välja att förbereda prover för endast en analys, vanligtvis mRNA, begränsa antalet biologiska frågor som kan undersökas. Dock ncRNAs spänner över flera klasser med föreskrivande roller att effekt mRNA uttryck. Eftersom ncRNA är viktiga grundläggande biologiska processer och störning i dessa processer i under infektion, kan de alltså göra attraktiva mål för therapeutics. Detta manuskript visar ett modifierat protokoll för generation mRNA och icke-kodande RNA uttryck bibliotek, inklusive viral RNA, från ett enda prov av helblod. Optimering av detta protokoll, förbättrad RNA renhet, ökade ligering för återvinning av metylerade RNAs och utelämnas storlek urval, för att tillåta fångst av fler RNA arter.
Introduction
Nästa generations sekvensering (NGS) har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för undersökningen av de förändringar som sker på genomisk nivå av biologiska organismer. Provberedning för NGS metoder kan varieras beroende på organismen, vävnadstyp, och viktigare frågorna forskarna är angelägen om att adressen. Många studier har vänt sig till NGS som ett sätt att studera skillnader i genuttryck mellan stater som friska och sjuka individer1,2,3,4. Den sekvensering ta plats på basis av hela genomet och tillåter forskare att fånga mest, om inte alla, genomisk information för en viss genetisk markör i taget pekar.
De vanligaste markörerna för uttryck som observerats är de messenger RNA (mRNA). De mest använda förfarandena för prepping bibliotek för RNA-seq är optimerade för återvinning av mRNA-molekyler med hjälp av en serie av reningar, splittringarna och nering5,6. Men är beslutet om hur ett protokoll ska utföras starkt beroende provtypen och frågor som om nämnda exempel. I de flesta fall är total-RNA extraherade; ännu, inte alla RNA-molekyler är av intresse och i sådana fall som mRNA uttryck studier alltför riklig RNA arter, som ribosomalt RNA (rRNA) måste tas bort för att öka antalet detekterbara avskrifter är associerad med mRNA. Den mest populära och mest använda metoden för att ta bort de rikliga rRNA-molekylerna är minskningen av polyadenylated RNA avskrifter som polyA utarmning7. Denna metod fungerar bra för analys av mRNA uttryck eftersom det inte påverkar mRNA avskrifter. Dock i studier som är intresserad av icke-kodande eller viral RNAs, polyA utarmning tar också bort dessa molekyler.
Många studier väljer att fokusera på RNA-sekvens bibliotek beredning att undersöka antingen mRNA uttryck (kodning) eller en särskild klass av små eller stora icke-kodande RNA. Det finns andra förfaranden8 som vår som tillåter dubbla provpreparering, förbereda många studier bibliotek från separata prover för separata studier när det är tillgängligt. För en studie som vår kräver detta normalt flera blodprov öka tid, förbrukningsvaror och djurens stress. Syftet med vår studie var att kunna använda helblod från djur att identifiera och kvantifiera de olika klasserna av både mRNA och icke-kodande RNA uttryckt mellan friska och högpatogen porcin reproduktions- och respiratorisk virus (HP-PRRSV) utmanade svin9,10 trots att endast ett enda helblod prov (2,5 mL) från varje gris. För att göra detta, behövs vi för att optimera de typiska utvinning och bibliotek skapande protokoll att generera korrekt data för analys av både mRNA och icke-kodande RNA (ncRNA) uttryck11 från ett enda prov.
Detta föranledde ett behov av ett protokoll som möjliggjorde mRNA och icke-kodande RNA analys eftersom tillgängliga standard kit och metoder för RNA-extraktion och bibliotek skapande var huvudsakligen avsedda för mRNA och använda en poly-A utarmning steg12. Detta steg skulle ha gjort det omöjligt att återställa icke-kodande RNA eller viral avskrifter från provet. Därför behövdes en optimerad metod som tillåts för total RNA-extraktion utan provet polyA utarmning. Metoden presenteras i detta manuskript har optimerats för användning av helblod som en Provtyp och bygga sekvensering bibliotek för både mRNA och ncRNAs av små och stora storlekar. Metoden har optimerats för att möjliggöra analys av alla detekterbara icke-kodande RNAs samt behålla viral RNAs för senare undersökning13. I alla tillåter vår optimerade bibliotek förberedelse protokoll för utredning av flera RNA-molekyler från ett enda hela blodprov.
Det övergripande målet bakom användningen av denna metod var att utveckla en process som tillåts för insamling av både icke-kodande RNA och mRNA från ett prov av helblod. Detta tillåter oss att ha mRNA, ncRNA och viral RNA för varje djur i vår studie som anskaffas från en enda prov9. Detta, i slutändan, möjliggör mer vetenskapliga upptäckter utan animaliska merkostnader och ger en mer komplett bild av uttrycket av varje enskilt prov. Den beskrivna metoden tillåter för undersökning av regulatorerna av genuttryck samt möjliggör komplettering av korrelat studier jämför både mRNA och icke-kodande RNA uttryck helblod prov. Vår studie använde detta protokoll för att undersöka förändringar i genuttryck och möjliga epigenetiska tillsynsmyndigheter i viralt infekterade 9 – veckor gammal kommersiella galtar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett första viktigt steg i det protokoll som gjorde det optimerade ingår extra globinzinkinsulin utarmning stegen, vilket gjorde det möjligt att få kvalitet läsningar från helblod prover. En av de största begränsningarna på använder helblod i sekvensering studier är det stora antalet läsningar i provet som kommer att mappa till globin molekyler och minska den läser som kan mappas till andra molekyler intresse18. Optimera i protokollet för våra provtyp, behövde vi, införliva en glob…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes främst av de av USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, och delvis av USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Denna studie stöddes delvis av en utnämning till jordbruks Service forskning deltagande forskningsprogrammet administreras av Oak Ridge Institutet för vetenskap och utbildning (ORISE) via en institutionsöverskridande avtal mellan oss Department of Energy ( DOE) och US Department of Agriculture. ORISE sköts av Oak Ridge associerade universiteten under DOE kontrakt inte. DE-AC05-06OR2310.
Vi vill tacka Dr Kay Faaberg för HP-PRRSV smittsamma klonerna, Dr Susan Brockmeier för hennes hjälp med djur involverad i experimentet, och Sue Ohlendorf för kontorstjänster i beredning av manuskriptet.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Referencias
- Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
- Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
- Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
- Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).
- Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
- Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
- Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
- Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
- . TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
- . New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018)
- Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).
