Identificación de la codificación y las clases de ARN no codificante expresado en cerdos sangre entera

Secuencia de la generación siguiente (NGS) ha surgido como una poderosa herramienta para la investigación de los cambios que ocurren a nivel genómico de organismos biológicos. Preparación de muestras para métodos NGS puede variar dependiendo del organismo, tipo de tejido, y lo más importante las preguntas de los investigadores están deseosos de dirección. Muchos estudios han recurrido a NGS como medio de estudiar las diferencias en la expresión génica entre Estados como individuos sanos y enfermos^1,2,3,4. La secuencia coloque sobre una base de todo el genoma y permite a un investigador capturar la mayoría, si no todos, de la información genómica para un determinado marcador genético a la vez el punto.

Los marcadores más comunes de expresión observados son el Mensajero RNAs (mRNAs). Los procedimientos más utilizados para preparar las bibliotecas para RNA-seq se optimizan para la recuperación de las moléculas de mRNA mediante el uso de una serie de purificaciones, fragmentaciones y trompas^5,6. Sin embargo, la decisión sobre cómo un protocolo debe realizarse depende en gran medida el tipo de muestra y las preguntas sobre dicha muestra. En la mayoría de los casos se extrajo ARN total; sin embargo, no todas las moléculas de ARN son de interés y en casos como los estudios de expresión de mRNA excesivamente abundantes especies de RNA, como el ARN ribosómico (ARNr) necesitan ser removidas para aumentar el número de transcripciones perceptibles asociados con los mRNAs. El método más popular y ampliamente utilizado para eliminar las abundantes moléculas de rRNA es la reducción de las transcripciones de cofia RNA conocido como polyA agotamiento⁷. Este enfoque funciona bien para el análisis de la expresión de mRNA como no afecta a los transcritos de ARNm. Sin embargo, en estudios que están interesados en RNAs no codificantes o virales, agotamiento de polyA también elimina estas moléculas.

Muchos estudios deciden centrarse en la preparación de biblioteca de secuencia de RNA para examinar cualquier expresión del mRNA (codificación) o una clase determinada de ARN no codificante de pequeño o grande. Aunque hay otros procedimientos⁸ como la nuestra que permiten la preparación de la muestra doble, muchos estudios preparan bibliotecas de muestras independientes para estudios por separado cuando esté disponible. Para un estudio como el nuestro, esto requeriría normalmente múltiples muestras de sangre, aumentando el tiempo, consumibles y el estrés animal. El objetivo de nuestro estudio era ser capaz de usar sangre de animales para identificar y cuantificar las diferentes clases de ambos mRNA y RNA no codificante expresó entre disgenésico sano y altamente patógena y virus del síndrome respiratorio (HP-PRRS) desafió a cerdos^9,10 a pesar de tener sólo una muestra de sangre entera sola (2,5 mL) de cada cerdo. Para ello, necesitábamos optimizar la extracción típica y protocolos de creación de biblioteca para generar los datos adecuados para permitir análisis de mRNA y no codificante del RNA (ncRNA) expresión¹¹ de una sola muestra.

Esto impulsó la necesidad de un protocolo que permitió mRNA y análisis de ARN no codificante porque los kits estándar disponibles y métodos para la extracción de RNA y biblioteca de la creación fueron pensados principalmente para mRNA y utilizan un agotamiento poly-A paso¹². Este paso habría hecho imposible recuperar ARN no codificante o transcripciones virales de la muestra. Por lo tanto, era necesario un método optimizado que permite para la extracción de RNA total sin agotamiento de polyA la muestra. El método presentado en este manuscrito se ha optimizado para permitir el uso de sangre entera como un tipo de muestra y construir bibliotecas de la secuencia de mRNA y ncRNAs de tamaños pequeños y grandes. El método ha sido optimizado para permitir el análisis de todos detectables no-codificación RNAs como retener RNAs virales para posterior investigación¹³. En todos, nuestro protocolo de preparación de biblioteca optimizada permite la investigación de múltiples moléculas de RNA de una muestra de sangre entera solo.

El objetivo detrás del uso de este método fue desarrollar un proceso que permitió la colección no codificante del RNA tanto de ARNm de una muestra de sangre entera. Esto nos permite tener ncRNA y mRNA y RNA viral para cada animal en nuestro estudio de una sola muestra⁹. Esto, en última instancia, permite el descubrimiento científico más sin costes adicionales de animales y da una imagen más completa de la expresión de cada muestra individual. El método descrito permite la examinación de los reguladores de expresión génica así como permitiendo estudios correlativos comparando ambos de mRNA y la expresión de RNA no codificante con una muestra de sangre entera sola. Nuestro estudio utiliza este protocolo para examinar los cambios en la expresión génica y posibles reguladores epigenéticos en viralmente infectaron cerdos comerciales masculinos 9 – semanas de edad.