Идентификация и кодирования кодирование классы РНК выражена в свином цельной крови
Summary
Здесь мы представляем протокол, оптимизированный для обработки кодирования (мРНК), и -кодирования (ncRNA) Глобин снижена РНК seq библиотек из одного состава крови.
Abstract
Появление новаторских и более мощный следующего поколения последовательности методов открыла новые направления в способности для изучения базовых экспрессии генов, связанных с биологическими процессами интерес. Эти нововведения позволяют не только исследователи соблюдать выражение из последовательности мРНК, которые код для генов клеточную функцию этот эффект, но также молекулы РНК (ncRNA)-кодирования, которые остаются без перевода, но все еще имеют функции регулирования. Хотя исследователи имеют возможность наблюдать за выражение mRNA и ncRNA, он был обычным для исследования сосредоточиться на одной или другой. Однако когда исследования заинтересованы экспрессии мРНК и ncRNA, во много раз они используют отдельные образцы для изучения кодирования или некодирующих РНК за счет разницы в библиотеке препаратов. Это может привести к необходимости более образцов, которые может увеличить время, расходных материалов и животных стресс. Кроме того это может привести к исследователи решили подготовить образцы для анализа только один, обычно мРНК, ограничивая количество биологических вопросов, которые могут быть исследованы. Однако ncRNAs охватывают несколько классов с нормативной роли это выражение mRNA эффект. Потому что во время инфекции являются важными для основных биологических процессов и расстройство этих процессов в ncRNA, они могут таким образом, сделать привлекательной цели для терапии. Эта рукопись демонстрирует изменение протокола для поколения мРНК и некодирующих РНК выражение библиотек, в том числе вирусной РНК, от одного образца цельной крови. Оптимизации этого протокола, улучшение чистоты РНК, увеличение перевязки для восстановления метилированной РНК и опустить выбор размера, чтобы разрешить захват более видов РНК.
Introduction
Следующего поколения последовательности (НГС) стала мощным инструментом для изучения изменений, которые происходят на уровне генома биологических организмов. Пробоподготовка для NGS методы можно варьировать в зависимости от организма, тип ткани, и что более важно вопросы исследователи стремятся адрес. Многие исследования обратились к NGS как средство изучения различий в экспрессии генов между государствами таких здоровых и больных лиц1,2,3,4. Последовательности занять место на основе всего генома и позволяет исследователь захватить наиболее, если не все, геномной информации для конкретного генетический маркер в то время.
Наиболее распространенными маркеры выражения наблюдается являются Посланник РНК (мРНК). Наиболее часто используемые процедуры prepping библиотек для РНК seq оптимизированы для восстановления молекул мРНК с помощью серии очищения, образовавшиеся и перешнуровок5,6. Однако решение о том, как протокол будет выполняться полагается на образец типа и вопросы о сказал образца. В большинстве случаев всего РНК добывается; Тем не менее не все молекулы РНК представляют интерес и в тех случаях, таких как исследования выражение mRNA чрезмерно обильные видов РНК, как рибосомная РНК (рРНК) должны быть удалены, чтобы увеличить количество обнаруживаемых стенограммы, связанные с мРНК. Наиболее популярным и широко используемым методом для удаления обильные молекул рРНК является сокращение polyadenylated РНК стенограммы, именуемый поля истощения7. Этот подход хорошо работает для анализа экспрессии мРНК, он не влияет на мРНК стенограммы. Однако в исследованиях, которые заинтересованы в некодирующих или вирусной РНК, истощение поля также удаляет эти молекулы.
Многие исследования решили сосредоточиться на подготовке библиотеки РНК последовательности изучить либо выражение mRNA (кодирование) или определенного класса малых или больших РНК-кодирования. Хотя есть другие процедуры8 , как наша, которые позволяют для двойной пробоподготовки, многие исследования готовиться отдельные исследования при наличии библиотек от отдельных образцов. Для исследования, как наша это обычно требуется несколько образцов крови увеличение времени, расходных материалов и животных стресс. Целью нашего исследования было чтобы иметь возможность использовать цельную кровь от животных для выявления и количественной оценки различных классов обоих мРНК и выразил РНК-кодирования между здоровым и высоко патогенного репродуктивно и вирус атипичной пневмонии (HP-PRRSV) оспорено свиней9,10 несмотря на наличие только одного состава крови (2,5 мл) от каждой свиньи. Чтобы сделать это, нам необходимо оптимизировать типичная добыча и протоколы создание библиотеки для создания правильных данных для анализа мРНК и некодирующих РНК (ncRNA) выражение11 от одного образца.
Это вызвало необходимость в протоколе, который позволил мРНК и анализа РНК-кодирования потому что доступны стандартные комплекты и методов для создания РНК добыча и библиотека были предназначены главным образом для мРНК и использовать поли А слоя шаг12. Этот шаг было бы невозможно восстановить некодирующих РНК или вирусный стенограммы из образца. Поэтому было необходимо оптимизированный метод что позволило общее извлечение RNA без истощения поля образец. Метод, представленный в этой рукописи была оптимизирована для использования цельной крови в качестве образца типа и для построения библиотек последовательность мРНК и ncRNAs малых и больших размеров. Этот метод был оптимизирован для анализа всех обнаружить РНК-кодирования, а также сохранить вирусной РНК для последующего расследования13. Во всех наши оптимизированные библиотеки подготовка протокол предусматривает расследование нескольких молекул РНК из одной цельной крови образца.
Общая цель за использование этого метода было разработать процесс, который позволил для коллекции некодирующих РНК и мРНК из одной пробы цельной крови. Это позволяет нам иметь мРНК, ncRNA и вирусной РНК для каждого животного в нашем исследовании, получены от одного образца9. Это, в конечном счете, позволяет более научное открытие без дополнительных затрат животных и дает более полную картину выражение каждого индивидуального образца. Описан метод позволяет для изучения регуляторов экспрессии генов, а также позволяет для завершения корреляционного исследования, сравнивающие оба мРНК и некодирующих РНК выражение с помощью одного состава крови. Наши исследования использовали этот протокол для изучения изменения в экспрессии генов и возможных эпигеномные регуляторы в вирусно зараженных 9 – неделя старый коммерческих хряков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Первым важным шагом в протоколе, что сделал это оптимизированный включали добавлен Глобин истощения шаги, которые позволили получить качество читает пробах цельной крови. Одним из крупнейших ограничений на использование цельной крови в последовательности исследования являются боль?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была главным образом поддержана USDA НИФА AFRI 2013-67015-21236 и частично путем USDA НИФА AFRI 2015-67015-23216. Это исследование отчасти поддержали назначение сельскохозяйственных исследований службы участие программа исследований ведении Окриджская институт науки и образования (ORISE) через межучрежденческое соглашение между (Министерство энергетики США Доу) и Департамент сельского хозяйства США. ORISE управляется Оук Ридж ассоциированных университетов по контракту Доу нет. ДЕ AC05-06OR2310.
Мы хотели бы поблагодарить д-р Кей Faaberg для HP-PRRSV инфекционные клоны, д-р Сьюзен Brockmeier за ее помощь с животными, участвующих в эксперименте и Сью Ohlendorf для секретарской помощи в подготовке рукописи.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Referencias
- Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
- Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
- Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
- Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).
- Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
- Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
- Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
- Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
- . TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
- . New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018)
- Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).
